Shrinky-Dink Opknoping Drops: een eenvoudige manier om vorm en cultuur Embryoid Bodies
Summary
We tonen een eenvoudige en snelle methode om vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling.
Abstract
Embryoid organen (EB) zijn aggregaten van embryonale stamcellen. De meest voorkomende manier van het creëren van deze aggregaten is de opknoping neerzetten, een moeizame aanpak van het pipetteren een willekeurig aantal cellen in well platen. De interacties tussen de stamcellen gedwongen in de nabijheid van elkaar bevordert de generatie van de EBS. Omdat de media in elk van de putten moet handmatig worden uitgewisseld elke dag, deze aanpak wordt met de hand intensief.
Bovendien, omdat de milieu-parameters zoals cel-cel, cel-oplosbare factor interacties, pH en beschikbaarheid van zuurstof kan worden functies van EB grootte, kan celpopulaties verkregen uit de traditionele opknoping daalt ook sterk variëren indien gekweekt onder identieke omstandigheden. Recente studies hebben inderdaad aangetoond dat het aanvankelijke aantal cellen die het aggregaat kan aanzienlijke gevolgen stamcellen differentiatie. We hebben een eenvoudige, snelle en schaalbare methode om cultuur vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling. Tot slot, deze cellen zijn gemakkelijk toegankelijk voor verdere analyse en experimenten. Deze methode is vatbaar voor een lab en vereist geen speciale apparatuur. Laten we zien deze methode door het creëren van embryoid lichamen met behulp van een rode fluorescerende muizen cellijn (129S6B6-F1).
Protocol
Discussion
We hebben een eenvoudige, snelle en schaalbare methode om cultuur vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten (gevormd uit Shrinky-Dinks) en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling. Tot slot, deze cellen zijn gemakkelijk toegankelijk voor verdere analyse en experimenten. Deze methode is vatbaar voor een lab en vereist geen speciale apparatuur, omdat wij overbodig fotolithografie. We kunnen variëren van de grootte van de microwells evenals de concentratie van cellen / putten om het aantal en de grootte…
Acknowledgements
We willen graag CIRM bedanken voor de ondersteuning van dit werk. De cellijn werd gedoneerd van Dr Andras Nagy het Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 | |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 | |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 | |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d | |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | ||||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
