Shrinky-gouttes pendantes Dink: une façon simple de formulaire et de la Culture corps embryoïdes
Summary
Nous montrons une méthode simple et rapide à charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes.
Abstract
Corps embryoïdes (EB) sont des agrégats de cellules souches embryonnaires. La façon la plus commune de créer ces agrégats est la méthode la goutte suspendue, une approche laborieuse de pipetage un nombre arbitraire de cellules dans des plaques bien. Les interactions entre les cellules souches contraints à proximité les uns des autres favorise la génération de l'EBS. Parce que les médias dans chacun des puits doit être manuellement échangés chaque jour, cette approche est manuellement intensives.
Par ailleurs, parce que les paramètres environnementaux, y compris cellule-cellule, les interactions de facteurs cellulaires solubles, le pH, l'oxygène et la disponibilité peuvent être des fonctions de la taille de EB, les populations cellulaires obtenues à partir traditionnelle gouttes suspendues peut varier considérablement, même quand elles sont cultivées dans des conditions identiques. Des études récentes ont en effet montré que le nombre initial de cellules formant l'agrégat peut avoir des effets significatifs sur la différenciation des cellules souches. Nous avons développé une méthode de culture simple, rapide et évolutive pour charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes. Enfin, ces cellules sont facilement accessibles pour une analyse plus approfondie et d'expérimentation. Cette méthode se prête à n'importe quel laboratoire et ne nécessite aucun équipement dédié. Nous démontrons cette méthode en créant des corps embryoïdes en utilisant une ligne rouge fluorescente de cellules de souris (129S6B6-F1).
Protocol
Discussion
Nous avons développé une méthode de culture simple, rapide et évolutive pour charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué (moulés à partir de Shrinky-Dinks) et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes. Enfin, ces cellules sont facilement accessibles pour une analyse plus approfondie et d'expérimentation. Cette méthode se prête à n'importe quel laboratoire et ne nécessite aucun équipement dédié, parce que nous parer à la nécessité pour la photolithographie. Nous pouvons…
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le CIRM pour le soutien de ce travail. La lignée cellulaire a été généreusement donnés par le Dr Andras Nagy à l'Hôpital Mount Sinai, à Toronto, en Ontario.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 | |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 | |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 | |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d | |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | ||||
References
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