Isolement des neutrophiles Protocole
Summary
Les neutrophiles sont parmi les premières cellules à arriver sur le site de la réponse immunitaire inflammatoire, et de leurs fonctions et mécanismes ont été largement étudiés in vitro. Nous démontrons une méthode de gradient de densité standard de séparation pour isoler les neutrophiles humains du sang total en utilisant des milieux de séparation disponibles commercialement.
Abstract
Neutrophiles polynucléaires neutrophiles (PMN) sont les leucocytes les plus abondants chez les humains et chez les premières cellules à arriver sur le site de la réponse immunitaire inflammatoire. En raison de leur rôle clé dans l'inflammation, les fonctions des neutrophiles tels que la locomotion, la production de cytokines, la phagocytose, et lutter contre des cellules tumorales sont largement étudiés. Afin de caractériser les fonctions spécifiques des neutrophiles, une méthode propre, rapide, fiable et de les séparer des autres cellules sanguines est souhaitable pour des études in vitro, en particulier depuis les neutrophiles sont de courte durée et doit être utilisé dans 2-4 heures de la collecte. Ici, nous démontrons une méthode de gradient de densité standard de séparation pour isoler les neutrophiles humains du sang total à l'aide des médias disponibles dans le commerce de séparation qui est un mélange de sodium et de métrizoate Dextran 500. La procédure se compose de couches de sang entier sur le moyen gradient de densité, la centrifugation, la séparation de la couche de neutrophiles, et la lyse des hématies résiduelles. Les cellules sont ensuite lavées, comptées et resuspendues dans un tampon à la concentration voulue. Quand elle est réalisée correctement, cette méthode a été démontré que le rendement des échantillons de> 95% des neutrophiles avec la viabilité> 95%.
Protocol
Discussion
La méthode de séparation en gradient de densité est utilisée pour isoler les neutrophiles humains du sang total en utilisant un mélange de sodium et de métrizoate Dextran 500. Cette méthode est basée sur la méthode de séparation des leucocytes mononucléaires par Boyum (1968) qui a été modifiée pour la séparation des neutrophiles par Ferrante et Thong (1980).
Après la collecte d'un donneur, du sang entier anticoagulé peut être avec de l'EDTA, du citrate ou héparine. Comme ils sont de courte durée, les neut…
Acknowledgements
Le financement du NIH R01 HL56621.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen Gibco | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Diagnostics | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield PoC | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | 其他 | Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen Gibco |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
