Neutrophile Isolation Protocol
Summary
Neutrophile Granulozyten gehören zu den ersten Zellen, die auf dem Gelände der entzündlichen Immunantwort kommen, und ihre Funktionen und Mechanismen wurden ausführlich in vitro untersucht. Wir zeigen eine Standard-Dichtegradienten Trennverfahren für die menschliche Neutrophile aus dem Vollblut unter Verwendung kommerziell erhältlicher Trennmedien isolieren.
Abstract
Neutrophile polymorphkernige Granulozyten (PMN) sind die häufigsten Leukozyten bei Menschen und unter den ersten Zellen, die auf dem Gelände der entzündlichen Immunantwort kommen. Aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei Entzündungen sind neutrophile Funktionen wie Fortbewegung, die Produktion von Zytokinen, Phagozytose und Tumorzellen zu bekämpfen intensiv untersucht. Zur Charakterisierung der spezifischen Funktionen der neutrophilen Granulozyten, ist eine saubere, schnelle und zuverlässige Methode zur Trennung von anderen Blutzellen wünschenswert, in-vitro-Studien, zumal Neutrophilen kurzlebig sind und sollte innerhalb von 2-4 Stunden nach der Entnahme verwendet werden. Hier zeigen wir eine Standard-Dichtegradienten Trennverfahren für die menschliche Neutrophile aus dem Vollblut unter Verwendung kommerziell erhältlicher Trennung Medien, die eine Mischung aus Natrium-metrizoate und Dextran 500 ist zu isolieren. Das Verfahren besteht aus Schichten Vollblut über den Dichtegradienten-Medium, Zentrifugation, Trennung von neutrophilen Schicht und Lyse der restlichen Erythrozyten. Die Zellen werden dann gewaschen, gezählt und in Puffer resuspendiert, um gewünschte Konzentration. Wenn richtig ausgeführt, hat diese Methode wurde gezeigt, dass Proben von> 95% Neutrophile mit> 95% Lebensfähigkeit zu erhalten.
Protocol
Discussion
Der Dichtegradient Trennverfahren wird verwendet, um menschliche Neutrophile aus Vollblut mit einer Mischung aus Natrium-metrizoate und Dextran 500 zu isolieren. Diese Methode basiert auf den mononukleären Leukozyten Trennverfahren durch Boyum (1968), die für die Neutrophilen Trennung von Ferrante und Thong (1980) wurde modifiziert, basiert.
Nach der Entnahme aus einem Spender, kann Vollblut mit EDTA, Citrat oder Heparin antikoaguliert werden. Da sie kurzlebig sind, sollten Neutrophilen innerhalb von 2-4 Stunden nach der Entnahme …
Acknowledgements
Die Finanzierung von NIH R01 HL56621.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen Gibco | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Diagnostics | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield PoC | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | 其他 | Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen Gibco |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
