Channelrhodopsin2 Mediated Stimulatie van synaptische Potentials op Drosophila Neuromusculaire verbindingen
Summary
Deze procedure maakt gebruik van een blauw licht geactiveerd algen kanaal en cel-specifieke genetische expressie tools om synaptische potentialen op te roepen met lichtpulsen op de neuromusculaire junctie (NMJ) in<em> Drosophila</em> Larven. Deze techniek is een goedkoop en makkelijk te gebruiken alternatief voor zuigkracht elektrode stimulatie voor synaptische fysiologie studies in onderzoek en onderwijs laboratoria.
Abstract
De<em> Drosophila</em> Larvale neuromusculaire voorbereiding heeft zich bewezen als een nuttig instrument voor het bestuderen van synaptische fysiologie worden<sup> 1,2,3</sup>. Momenteel is de enige beschikbare middelen prikkelend junctionele potentials (EJPs) op te roepen in dit preparaat omvat het gebruik van de zuigkracht elektroden. In zowel onderzoek als onderwijs labs, studenten vaak moeite hebben om te manoeuvreren en manipuleren van dit soort stimulerende elektrode. In dit werk, laten we zien hoe op afstand synaptische potentialen te stimuleren op het larvale NMJ zonder het gebruik van zuigkracht elektroden. Met het uitdrukken van channelrhodopsin2 (ChR2)<sup> 4,5,6</sup> In<em> Drosophila</em> Motorneuronen het gebruik van de<em> GAL4-UAS</em> Systeem<sup> 7</sup>, En het maken van kleine wijzigingen in een basic rig elektrofysiologie, waren we in staat om een betrouwbare EJPs roepen met pulsen van blauw licht. Deze techniek kan van bijzonder het gebruik in het onderwijs neurofysiologie laboratoria waar de student rig praktijk tijd en middelen zijn beperkt.
Protocol
Discussion
Kritische stappen omvatten zowel de initiële dissectie en het invoeren van spiercellen. Als zenuwen zijn doorgesneden of spier is beschadigd tijdens de eerste dissectie is het moeilijk om door te gaan de rest van het experiment. Tijdens de dissectie, moet men zeer voorzichtig te ontleden schaar omhoog zoveel mogelijk hoek tijdens de dorsale incisie. Tijdens de tweede cruciale stap, het invoeren van een spiercel, moet men kijken naar een hyperpolarisatie verleden ~ 30 mV. Waarden boven de -30 mV geven aan dat de elektro…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health beurzen RO1GM-33205 en de MH-067284 naar LC Griffith en door een Brandeis University zomer undergraduate research beurs NJ Hornstein. Voorlopige experimenten voor deze techniek werden uitgevoerd bij de Marine Biological Laboratory in het kader van de 2008 Neural Systems and Behavior zomer cursus (NIMH te verlenen: R25 MH059472) in Woods Hole, Massachusetts.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
| Sylgard | Ellsworth adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com | |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com | |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | ||
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com | |
| Powerlab 4/30 data acquisition system | AD instruments | www.adinstruments.com | ||
| Grass stimulator | Grass instruments | www.grasstechnologies.com | ||
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | ||
| Dissecting Scope | Leica | www.leica-microsystems.com | ||
| Light Source | Dolan-Jenner | 41446-062 | www.dolan-jenner.com | |
| Fly Media | ||||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com | |
| OK-371 Gal4 Flies | Aberle lab, Griffith lab, Bloomington stock center | |||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | |||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
||
| LED Heat Sink | Thor Labs | http://www.thorlabs.com/ | ||
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | ||
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | |||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Leitz | ACS01 | www.leica-microsystems.com | |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | ||
| Borosilicate Glass | FHC | www.fh-co.com/p14-15.pdf | ||
| Electrode Puller | Sutter Instruments | www.sutter.com | ||
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
|||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
Referenzen
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, . . Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , (2004).
