Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar
Summary
Bu prosedür sinaptik potansiyeller, nöromüsküler bileşke (NMJ) ışık darbeleri ile uyandırmak için mavi bir ışık ile aktive alg kanal ve hücre spesifik genetik ifade araçları kullanır<em> Drosophila</em> Larvaları. Bu teknik, bir ucuz ve emme elektrot stimülasyon, araştırma ve eğitim laboratuvarları sinaptik fizyolojisi çalışmaları için alternatif kullanımı kolay.
Abstract
<em> Drosophila</em> Larva nöromüsküler hazırlık sinaptik fizyolojisi eğitimi için yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır<sup> 1,2,3</sup>. Şu anda, sadece bu hazırlık eksitatör junctional potansiyelleri (EJPs) uyandırmak için kullanılabilir anlamına gelir emme elektrot kullanımı içerir. Hem de araştırma ve eğitim laboratuvarları, öğrencilerin sık sık bu tür uyarıcı elektrot manevra ve manipüle zorluk var. Bu çalışmada, biz emme elektrot kullanmadan uzaktan larva NMJ sinaptik potansiyeller uyarmak için nasıl göstermektedir. Channelrhodopsin2 (ChR2) ifade<sup> 4,5,6</sup><em> Drosophila</em> Motor nöronların<em> GAL4-UAS</em> Sistem<sup> 7</sup> Ve temel elektrofizyoloji donatmak için küçük bir değişiklik yaparak, mavi ışık darbeleri ile EJPs güvenilir bir şekilde uyandırmak için başardık. Bu teknik, özellikle öğrenci teçhizat uygulama zamanı ve kaynakları sınırlı nörofizyoloji öğretim laboratuvarlarında kullanımı olabilir.
Protocol
Discussion
Kritik adımlar ilk diseksiyon ve kas hücrelerine girişini içerir. Ilk diseksiyon sırasında sinirler kesilir veya kas bozuksa bu deney geri kalanı devam etmek zordur. Diseksiyon sırasında, bir dorsal insizyon sırasında yukarı doğru mümkün olduğunca makas diseksiyon açısını çok dikkatli olmalıdır. Ikinci önemli adım sırasında, bir kas hücreye girerek, bir geçmişte bir hiperpolarizasyon ~ 30 mV için dikkat etmeniz gerekir. -30 MV Yukarıdaki değerler, elektrot, bir kas hücre içinde ya da s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Sağlık hibe RO1GM-33205 ve MH-067.284 LC Griffith Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından ve Brandeis Üniversitesi NJ Hornstein yaz lisans araştırma bursu tarafından desteklenmiştir. Woods Hole, MA: 2008 Sinir Sistemleri ve Davranış yaz kursu (R25 MH059472 NIMH hibe) bir parçası olarak bu tekniği için ön deneyler Deniz Biyoloji Laboratuvarı yapıldı.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
| Sylgard | Ellsworth adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com | |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com | |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | ||
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com | |
| Powerlab 4/30 data acquisition system | AD instruments | www.adinstruments.com | ||
| Grass stimulator | Grass instruments | www.grasstechnologies.com | ||
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | ||
| Dissecting Scope | Leica | www.leica-microsystems.com | ||
| Light Source | Dolan-Jenner | 41446-062 | www.dolan-jenner.com | |
| Fly Media | ||||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com | |
| OK-371 Gal4 Flies | Aberle lab, Griffith lab, Bloomington stock center | |||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | |||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
||
| LED Heat Sink | Thor Labs | http://www.thorlabs.com/ | ||
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | ||
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | |||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Leitz | ACS01 | www.leica-microsystems.com | |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | ||
| Borosilicate Glass | FHC | www.fh-co.com/p14-15.pdf | ||
| Electrode Puller | Sutter Instruments | www.sutter.com | ||
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
|||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
Referenzen
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, . . Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , (2004).
