신경 튜브 형성 후, neuroepithelium은 수축과 튜브가 배아 두뇌 심실을 형성하기 위해 배아 뇌척수 (eCSF)로 채우고 동안 주름. 우리는 더 나은 라이브 배아에서 neuroepithelial 모양 대조적으로 액체 채워진 공간을 시각화이 뇌실 주입 기술을 개발했습니다.
Abstract
배아 두뇌 개발하는 동안 적절한 두뇌 뇌실 형성은 정상적인 뇌 기능이 필요합니다. 뇌 심실은 뇌척수로 가득하는 두뇌 내의 고도 보존 충치 있습니다. 그것이 두뇌 뇌실 형성의 결과로 액체로 채우고있는 동안 zebrafish에서 신경 튜브 형성 후, neuroepithelium는 constrictions과 주름 일련의를 겪습. 뇌실 형성 과정과 동시에 발생하는 neuroepithelial 모양의 변화를 이해하기 위해서, 우리는 뇌 조직에 비해 뇌실 공간을 시각화하는 방법이 필요했습니다. 그러나, 투명한 zebrafish의 배아의 본질은 어려운 뇌실 우주에서 조직을 차별화 수 있습니다. 따라서, 우리는 뇌실 공간이 형광 염료 가득한과 브라이트 및 형광 현미경으로 몇 군데있는 두뇌 뇌실 사출 기술을 개발했습니다. 브라이트과 형광 이미지는 다음 처리와 포토샵으로 겹쳐있다. 이 기법은 브라이트 이미지의 neuroepithelium의 형태 비교, 형광 염료와 뇌실 공간의 시각화를위한 수 있습니다. zebrafish의 뇌 뇌실 주입은 초기 애벌레 단계를 통해 18시간 게시물 수정에서 근무하실 수 있습니다. 우리는뿐만 아니라 두뇌 morphogenesis의 돌연변이 (1-3)를 특성화 같이 뇌실 뇌 형성과 morphogenesis 우리의 연구에 광범위하게이 기술을 사용했습니다.
Protocol
프로토콜 1 부 : microinjection에 대비하여 서터 인스 트루먼 트의 바늘 풀러를 사용하여 모세 바늘을 떼어하여 사출을위한 준비. 형광 염료 (예 : 텍사스 – 레드 Dextran 등)로 바늘을 입력합니다. micromanipulator과 microinjection 장치에 바늘을 탑재합니다. beveled 팁을 만들 수있는 각도로 적절한 크기로 바늘을 잘라요. 드롭 크기를 측정하고 기름 주입…
Discussion
이 비디오에서 우리는 zebrafish 두뇌 심실 개발에 형광 염료 (텍사스 – 레드 Dextran)를 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 주변 neuroepithelium 달리 뇌 뇌실 공간을 시각화하는 데 사용과 뇌실 공간의 형태뿐 아니라 주변의 뇌 조직의 모양을 결정하는 매우 유용합니다. 우리가 더 나은 살아있는 배아에서 시간이 지남에 따라 뇌 뇌실 형성 및 뇌 morphogenesis의 과정을 이해할 수 있습니다. 이 기술?…
Acknowledgements
저자는 실험실에서이 기술을 개발 로라 앤 로우 어리 감사하고 싶습니다. HS는 NIHMH70926에 의해 지원됩니다. 제니퍼 구츠맨은 CSBi / 머크 박사 친교에 의해 지원되었다.
Materials
Material Name
Typ
Company
Catalogue Number
Comment
Forceps
Tool
Fine Science Tools
11252-20
Capillary Tubes (needles)
Tools
Frederick Haer and Co.
30-30-1
Agarose-Coated dishes
Tools
Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)
Agarose (50027) Dishes (430166)
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope
Microscope
Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software
Tools
1-200 μ pipette tips
Tools
Tip One, US Scientific
1111-0806
These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop
Image Analysis
Adobe
Embryo Loop
Tools
Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector
Tools
Medical Systems Research Products Harvard Apparatus
PL1-100
Needle Puller
Tools
Sutter Instruments
Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).