После нейронных формирование трубки, нейроэпителия сужает и складок в то время как трубка наполняется эмбриональной цереброспинальной жидкости (eCSF) с образованием эмбриональных желудочков мозга. Мы разработали эту технику инъекции желудочка лучше визуализировать заполненных жидкостью пространство в отличие от нейроэпителиальных формы в живой эмбрион.
Abstract
Правильное формирование желудочка мозга в процессе эмбрионального развития мозга необходимы для нормальной функции мозга. Желудочки мозга хорошо сохранились и полости внутри мозга, которые заполнены спинномозговой жидкости. В данио, после нейронных формирование трубки, нейроэпителия претерпевает ряд перетяжек и складок в то время как он наполняется жидкостью в результате чего мозг формирование желудочка. Для того чтобы понять процесс желудочка формирования и нейроэпителиальных меняет свою форму, которые происходят в то же время, нам нужно способ визуализации желудочка пространства по сравнению с мозговой ткани. Тем не менее, характер прозрачных эмбрионах данио делает его трудно отличить от ткани желудочка пространства. Поэтому мы разработали инъекцию желудочков мозга техники, где желудочка пространство заполнено флуоресцентным красителем и изображено светлое и люминесцентной микроскопии. Светлое и флуоресцентные изображения затем обрабатывается и накладывается в Photoshop. Этот метод позволяет для визуализации желудочка пространство с флуоресцентным красителем, по сравнению с формой нейроэпителия в образе светлого. Мозг желудочка инъекций в данио рерио могут быть использованы с 18 часа после оплодотворения до начала личиночной стадии. Мы использовали этот метод широко в наших исследованиях мозга формирование желудочка и морфогенеза, а также для характеристики мозга морфогенеза мутантов (1-3).
Protocol
Протокол Часть 1: Подготовка к микроинъекции Подготовка к инъекции, потянув капиллярных игл использованием Саттер инструменты игла съемника. Заполните игла с флуоресцентной краской (такие как Техас-красный Декстран). Горы иголку в аппарате микроманипуля…
Discussion
В этом видео показано, как вводить флуоресцентного красителя (Техас-красный декстрана) в развивающиеся данио желудочков мозга. Этот метод используется для визуализации пространства желудочков мозга в отличие от окружающих нейроэпителия и является чрезвычайно полезным для определен?…
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Лаура Энн Лоури, который разработал эту технику в лаборатории. HS поддерживается NIHMH70926. Дженнифер Gutzman была поддержана CSBI / Merck докторской стипендии.
Materials
Material Name
Typ
Company
Catalogue Number
Comment
Forceps
Tool
Fine Science Tools
11252-20
Capillary Tubes (needles)
Tools
Frederick Haer and Co.
30-30-1
Agarose-Coated dishes
Tools
Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)
Agarose (50027) Dishes (430166)
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope
Microscope
Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software
Tools
1-200 μ pipette tips
Tools
Tip One, US Scientific
1111-0806
These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop
Image Analysis
Adobe
Embryo Loop
Tools
Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector
Tools
Medical Systems Research Products Harvard Apparatus
PL1-100
Needle Puller
Tools
Sutter Instruments
Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).