Selectie, micro-injectie, en de beeldvorming van fluorescent-gelabeld F-actine via fluorescentie microscopie spikkel (FSM).
Abstract
In dit protocol beschrijven we het gebruik van TL-Speckle Microscopy (FSM) om hoge-resolutie afbeeldingen van actine dynamiek vast te leggen in PtK1 cellen. Een uniek voordeel van FSM is de mogelijkheid om de beweging en de omzet kinetiek (montage / demontage) van de F-actine-netwerk vast te leggen in levende cellen. Deze techniek is vooral handig bij de afleiding van kwantitatieve metingen van F-actine dynamiek wanneer gecombineerd met computer vision software (qFSM). We beschrijven de selectie, micro-injectie en visualisatie van fluorescerende probes actine in levende cellen. Belangrijk is dat soortgelijke procedures zijn van toepassing op het visualiseren van andere macomolecular assemblages. FSM is aangetoond voor microtubuli, intermediaire filamenten, en hechting complexen.
Protocol
Deel 1: Het verkrijgen van uw fluorescent gelabelde actine voor FSM Materialen die nodig zijn: gezuiverd actine, fluorofoor (Alexa, X-rhodamine aanbevolen). G-buffer, ultracentrifuge Een belangrijk onderdeel voor het verwerven van een goede FSM films is de juiste etikettering van actine (of andere cytoskeleteiwitten) met de fluorofoor van uw keuze. Wij raden u aan fluoroforen van Alexa (488, 568 golflengten) en X-rhodamine succinimidylester derivaten die lysineresiduen rich…
Discussion
Een aantal belangrijke factoren van cruciaal belang zijn voor het succesvol behalen van spikkel beelden, hoe goed spikkels beginnen en eindigen met de kwaliteit van uw fluorescent gelabelde actine. Een hoge verhouding tussen de etikettering van kleurstof tot actine monomeren, die rond 0,4 tot 0,7 zal ervoor zorgen dat spikkels zal verschijnen helder en discreet, terwijl de gelabelde eiwit zelf moet oplosbaar en vrij van aggregaten. Even belangrijk is de micro-injectie procedure. Om ervoor te zorgen normale cel homeostas…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De ontwikkeling van qFSM wordt gefinancierd door de NIH subsidie U01 GM06230.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325, doi:10.3791/1325 (2009).