가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

Summary

규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.

Abstract

플라즈마 막 단백질은 수용체, 이온 채널, 전송기 및 펌프로 구성된 단백질 많은 다양한 그룹입니다. 이 단백질의 활동이 양분 전달, 세포 흥분, 화학 신호를 포함한 주요 세포 행사의 다양한 책임이 있습니다. 대부분의 플라스마 막 단백질은 동적 단백질 표면 표현을 변경하여 단백질 기능을 modulates endocytic 인신 매매에 의해 규제됩니다. 단백질 endocytosis를 촉진 메커니즘은 복잡하며 충분히 많은 막 단백질에 대한 이해되지 않습니다. 완전히 주어진 단백질의 endocytic 밀매를 제어하는​​ 메커니즘을 이해하기 위해서는 단백질의 endocytic 속도가 정확하게 측정하는 것이 중요합니다. 많은 수용체에 대한 직접 endocytic 속도 측정이 자주 표시 수용체 리간드를 활용 달성하고 있습니다. 그러나, 전송기, 펌프와 이온 채널과 같은 막 단백질의 여러 클래스에 대한, endocytic 속도를 측정하는 데 사용할 수있는 편리 리간드가 없습니다. 현재 보고서에서, 우리는 도파민 수송 (DAT) endocytic 속도를 측정하기 위하여 고용 가역 biotinylation 방법을 설명합니다. 이 방법은 국제화 속도를 측정하는 간단한 방법을 제공하며, 쉽게 대부분의 막 단백질의 밀매 연구에 대한 고용 수 있습니다.

Protocol

절차 개요 : 이 방법을 사용하여, 세포 표면 단백질은 covalently (그림 참조 1. 인신 매매 제한 조건 (즉, 낮은 온도)에서 막 impermeant, 이황화 결합 biotinylation 시약을 (sulfo – NHS – SS – 비오틴)를 사용하여 사용 가능한 세포 리신 잔류물에 비오틴과 레이블 아르 그림에 대한). 세포 중 하나 세트 매매 허용 조건 이동 (37 ° C)와 biotinylated 단백질 internalize입니다. 세포의 다른 집합 시간 = 0 …

Discussion

일반적인 문제 :이 실험에서 발생하는 가장 일반적인 문제는 가난한 스트립의 효율성이다. 스트립의 효율 결과를 해석하는 수있는에 중요합니다. 스트립은 매우 효율적인 게 아니라면, 그것은 국제화 차선에 biotinylated 단백질의 표면에서 internalized 사실에 있다고 결론하는 것은 불가능합니다. 스트립 ≥ 90 % 효율이 최적이며, 스트립이 수준 아래로 떨어지면면 우리는 어떤 결과를 폐기하십시…