ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים
Summary
מאמר זה מתאר GFP מבוססי פלואורסצנציה<em> In vivo</em> מבחני כי בנפרד לכמת הומולוגיים רקומבינציה ו nonhomologous סוף להצטרף בתאי יונקים.
Abstract
גדיל הדנ"א הכפול הפסקות הם נגעים DNA המסוכן ביותר שעלול להוביל לאובדן מסיבי של מידע גנטי ומוות התא. תאים לתקן DSBs באמצעות שני מסלולים עיקריים: nonhomologous סוף להצטרף (NHEJ) ו הומולוגיים רקומבינציה (HR). הפרעות של NHEJ ו HR הקשורים לעתים קרובות עם הזדקנות מוקדמת ו tumorigenesis, ולכן חשוב לנו דרך כמותית למדוד כל מסלול תיקון DSB. המעבדה שלנו פיתחה בונה כתב ניאון המאפשרים מדידה כמותית של רגיש NHEJ משאבי אנוש. בונה מבוססים על גן ה-GFP מהונדסים המכיל אתרים הכרה endonuclease I-SCEI נדיר חיתוך לזירוז של DSBs. בונה החל GFP הם שליליים כמו הגן GFP הוא מובטל ידי אקסון נוספת, או על ידי מוטציות. תיקון מוצלח של שוברת את I-SCEI הנגרמת על ידי NHEJ או HR משחזר את גן ה-GFP תפקודית. מספר התאים GFP חיובי נספר על ידי cytometry זרימה מספקת למדוד כמותית של NHEJ או יעילות משאבי אנוש.
Protocol
Discussion
NHEJ פלורסנט מבחני HR כתב לספק דרך כמותית למדוד בנפרד עבור כל מסלול תיקון DSB in vivo. מבחני רגישים מאוד, כמו FACS יכולים לזהות באופן אמין 10 + התאים GFP ב 20,000 תאים. מבחני עשוי להיות מותאם למדידת אירועים לתקן "בזמן אמת" על ידי איתור את המראה של ה-GFP בתאים + בתוך דקות או שעות ל…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המקורי GFP-Pem1 היה מתנה ד"ר Li Lei. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH ו הרפואי אליסון קרן אל VG ו AS
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
Referenzen
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
