Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi
Summary
Bu makale, GFP tabanlı floresan açıklar<em> In vivo</em> Homolog rekombinasyon ayrı ayrı ölçmek ve nonhomologous memeli hücrelerinde katılmadan sonunda testleri.
Abstract
DNA çift iplikli sonları büyük kaybı genetik bilgi ve hücre ölümüne yol açabilecek en tehlikeli DNA lezyonlar. Hücreler onarım DSBs katılmanın nonhomologous sonunda (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR): iki ana yollar kullanarak. NHEJ ve İK pertürbasyonlarının genellikle erken yaşlanma ve tümörogenez ile ilişkili, dolayısıyla her DSB onarım yolu ölçme nicel bir şekilde olması önemlidir. Laboratuvarımız NHEJ ve İK hassas ve kantitatif ölçümüne olanak floresan muhabiri yapıları geliştirmiştir. Yapıları DSBs indüksiyonu için nadir bir kesme-SCEI endonükleaz tanınması siteleri içeren bir mühendislik, GFP geninin dayanmaktadır. Ek bir ekson GFP geninin inaktive veya mutasyonlarla olduğu gibi başlangıç yapıları GFP negatif. NHEJ veya İK I-SCEI indüklenen sonlarının Başarılı onarım fonksiyonel GFP genini geri yükler. Flow sitometri sayılır GFP pozitif hücrelerin sayısı NHEJ kantitatif ölçü veya İK verimliliği sağlar.
Protocol
Discussion
Floresan NHEJ ve İK muhabiri deneyleri, in vivo olarak ayrı ayrı her bir DSB onarım yolu ölçmek için nicel bir yol sağlar. Deneyleri, FACS güvenilir 20.000 hücre 10 GFP + hücreleri tespit edebilen çok duyarlıdır. Testler GFP + hücreler görünümünü DSBs 2 indüksiyon sonrası dakika veya saat içinde tespit ederek "gerçek zamanlı" onarım olaylarını ölçmek için adapte olabilir. Ayrıca, GFP + hücrelerin analizi DSB onarım sonra farklı hücre döngüsü aşamasın…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Orijinal GFP-Pem1 Dr Lei Li bir hediye oldu. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve Ellison Tıp Vakfı VG hibe tarafından desteklenen ve AS
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
Referenzen
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
