Uma injeção de. Embriões stephensi para gerar malária resistente a mosquitos

Summary

Mosquitos Anopheles stephensi são vetores da malária e da Índia que habitam em toda a Ásia. Este vídeo demonstra a técnica para a realização de microinjeções desta espécie com transgenes que conferem resistência à malária para o mosquito. Grande parte da metodologia demonstrada neste vídeo é aplicável às técnicas de microinjeção de outras espécies de mosquito.

Abstract

A introdução de genes exógenos em genomas de mosquitos exige técnicas de microinjeção sob medida para as espécies de interesse específicos. Este protocolo de vídeo demonstra um método utilizado pelo laboratório de James para microinject constrói DNA em embriões de Anopheles stephensi para a geração de mosquitos transformada. Técnicas de preparação agulhas microinjeção, coleta e preparação de embriões e na execução da microinjeção são ilustradas.

Protocol

Preparação antes da microinjeção: Mosquitos alimentam de sangue: para injeção de segunda a quarta-feira fêmeas alimentam na sexta-feira anterior. Para injetar quinta-feira e sexta-feira, as fêmeas se alimentam de segunda-feira da mesma semana. Prepare as agulhas de quartzo usando o programa 2 e tampão isotônica (veja Materiais). "Deitado tubo" para os embriões é o frasco de cultura regulares Drosophila. Algodão molhado no fundo, com um disco d…

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
Injection Quartz needles		Sutter Instrument		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Quiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification