אנו מציגים פרוטוקול לייצר אנטיגן ספציפי עכבר מתאי T באמצעות התמרה retroviral
T-cell קולטנים (TCRs) תפקיד מרכזי במערכת החיסון. TCRs על תא T משטחים ניתן לזהות באופן ספציפי אנטיגנים פפטידים שהוצגו על ידי תאים המציגים אנטיגן (נגמ"שים) 1. הכרה זו מובילה ההפעלה של T-תאים סדרה של תוצאות תפקודיות (כגון ייצור ציטוקינים, הריגת התאים היעד). הבנת תפקיד פונקציונלי של TCRs הוא קריטי כדי לרתום את כוחה של המערכת החיסונית לטיפול במגוון של מחלות הקשורות אימונולוגיה (סרטן אוטואימוניות כגון או).
זה נוח ללמוד TCRs בעכברי מודל, אשר יכול להתבצע בכמה דרכים. ביצוע TCR מהונדס מודלים העכבר הוא יקר זמן רב, וכיום יש רק מספר מוגבל של אותם לזמינים 2-4. לחלופין, בעכברים עם אנטיגן ספציפי מתאי T יכול להיות שנוצר על ידי מח העצם הכימרה. שיטה זו גם לוקח מספר שבועות ומחייב מומחיות 5. התמרה retroviral של TCRs לתוך מבחנה מופעל עכבר מתאי T הינה שיטה מהירה וקלה יחסית להשיג מתאי T של סגוליות פפטיד MHC הרצוי. Antigen ספציפיות מתאי T יכול להיווצר בשבוע אחד המשמש את כל היישומים במורד הזרם. לימוד transduced מתאי T יש גם יישום ישיר חיסוני אנושי, כמו העברת המאמצת של האדם מתאי T transduced עם אנטיגן ספציפי לערמונית TCRs היא אסטרטגיה המתעוררים לטיפול בסרטן 6.
כאן אנו מציגים פרוטוקול retrovirally transduce TCRs לתוך מבחנה מופעל עכבר מתאי T. שני גנים אנושיים בעכבר TCR ניתן להשתמש. רטרווירוסים נושאת גנים ספציפיים TCR נוצרים נהגו להדביק עכבר מתאי T מופעלים עם נוגדנים אנטי CD3 ו CD28 אנטי. לאחר בהרחבת חוץ גופית, transduced מתאי T מנותחים על ידי cytometry הזרימה.
מספר צעדים חיוניים כדי להשיג תוצאות אופטימליות. Plat-E התא קו האריזה צריכים להיות כל הזמן במצב בריא. אם יש צורך, התאים יכולים להיות passaged כמה פעמים DMEM בינוני עם 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin, 10 מיקרוגרם / מ"ל blasticidin למנוע אובדן של הביטוי retroviral מבנה החלבון. ביום transfection, התאים צריכים להיות ומחוברות ~ 80%. תאים מעט מדי או יותר מדי עשוי להפחית את כייל הנגיף. איכות הנגיף ניתן לבדוק על ידי בדיקת על שורות תאים שניתן בקלות transduced. מאז TCRs דורשים CD3 מתחמי לבוא לידי ביטוי על פני התא, אנו משתמשים באופן שגרתי 58α-/β- תאים hybridoma 10 (קו התא אינו מבטא אנדוגני TCR או שרשרת α β, אך אינו מורכב להביע CD3). אנו להשיג כמעט 100% התמרה היעילות של תאים hybridoma כאשר transducing תאים עם 1 מ"ל של supernatant וירוס. לבסוף, ה-T לתאים צריך להיות מופעל מתרבים כי רטרווירוס יכול רק להדביק באופן פעיל בחלוקת תאים.
השיטה המוצגת כאן להפקת אנטיגן ספציפי מתאי T יש מספר מגבלות. ראשית, קשה להגיע ליעילות התמרה 100% עבור העכבר העיקרי מתאי T. חלק מן התאים אינם מבטאים את TCR של עניין. שנית, transduced TCR α β ורשתות יכול mispair עם TCRs אנדוגני 9, אשר עשוי להפחית את רמת הביטוי של TCR של עניין. בנוסף, TCRs mispaired עלול לגרום אוטואימוניות in vivo 11. לבסוף, יש רק מסגרת זמן מוגבלת transduced מתאי T ניתן להשתמש. אחרי בערך שבוע, התאים עוברים אפופטוזיס אלא אם כן להיות מחדש מגורה. עם זאת, תאים עשויים להיות מותשים לאבד פונקציות עם גירויים חוזרים מחדש.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH (5U01CA137070) לבין האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן (RSG-09-070-01-LIB), חוקר במכון לחקר הסרטן פרס (ח"כ), הלב האגודה האמריקאית טרום דוקטורט המילגה (ק"מ) משרד ספרדית החינוך והמדע Fellowship (APG).
ברצוננו להודות לד"ר ניקולס Restifo וד"ר Zhiya יו (NIH / NCI) עבור הצעות מועילות לפרוטוקול.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | ||
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | ||
Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | ||
1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | ||
Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | ||
Recombinant human IL2 | Peprotech | 200-02 | ||
Anti-CD3e antibody | BD Bioscience | 553057 | ||
Anti-CD28 antibody | BD Bioscience | 553294 | ||
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | ||
OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | ||
10cm Poly-lysine coated plates | BD Bioscience | 356469 | ||
pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | ||
Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | ||
DMEM | Invitrogen | 12491-023 | ||
FBS | Hyclone | SH3008803 | ||
Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | ||
L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | ||
Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | ||
Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | ||
RPMI | Invitrogen | 12633-020 | ||
β- Mercaphoethanol | Invitrogen | 21985-023 |
Media:
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid).
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep).
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaphoethanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate).