Мы представляем протокол производить антиген-специфические Т-мышь клеток с использованием ретровирусной трансдукции
Т-клеточных рецепторов (TCR) играют центральную роль в иммунной системе. ТКО на Т-клеточной поверхности могут специально признать пептидные антигены, представленные антиген представляющих клеток (БТР) 1. Это признание ведет к активации Т-клеток и ряда функциональных результатов (например, продукции цитокинов, убийство клеток-мишеней). Понимание функциональной роли ТКО имеет решающее значение для использования возможностей иммунной системы для лечения различных заболеваний, связанных иммунологии (например, рака или аутоиммунных заболеваний).
Это удобно для изучения ТКО на мышах, которая может быть выполнена несколькими способами. Создание TCR трансгенных мышах стоит дорого и отнимает много времени и в настоящее время Есть только ограниченное число их доступными 2-4. Кроме того, мыши с антиген-специфических Т-клеток может быть порождена костного мозга химера. Этот метод также занимает несколько недель и требует экспертных знаний 5. Ретровирусные трансдукции ТКО в в пробирке активированный мыши Т-клеток является быстрым и относительно простой способ получения Т-клетки желаемый пептид-МНС специфику. Антиген-специфические Т-клетки могут быть получены в течение одной недели и использовать в любых приложениях вниз по течению. Изучение трансдуцированных Т-клетки также имеет прямое отношение к человеческой иммунотерапия, как приемные передачи человеческих Т-клеток трансдуцированных с антиген-специфические ТКО является новой стратегией для лечения рака 6.
Здесь мы приводим протокол retrovirally преобразовывать в ТКО в пробирке активированный мыши Т-клеток. Оба человека и мыши TCR генов могут быть использованы. Ретровирусы проведения специфических генов TCR генерируются и используются для заражения мышей Т-клетки, активированные с анти-CD3 и анти-CD28 антител. После того как в пробирке расширения, трансдуцированных Т-клетки анализировали с помощью проточной цитометрии.
Несколько шагов имеют решающее значение для достижения оптимальных результатов. Плат-E упаковки клеточной линии следует иметь в здоровом состоянии. Если необходимо, ячейки могут быть пассировать несколько раз в среде DMEM с 1 мкг / мл пуромицина, 10 мкг / мл blasticidin для предотвращения потери ретровирусных выражение структуры белка. В день трансфекции клетки должны быть ~ 80% вырожденная. Слишком мало или слишком много клеток может привести к снижению титра вируса. Вирус качества может быть проверена путем тестирования на клеточных линий, которые могут быть легко трансдуцированных. С ТКО требуют CD3 комплексов, которые будут высказаны на поверхности клеток, мы обычно используем 58α-/β- гибридомных клеток 10 (клеточная линия, что не выражает эндогенных TCR α или β цепи, но не выразить CD3 комплекса). Получено почти 100% эффективностью трансдукции гибридомных клеток при трансдукции клеток с 1 мл вируса супернатант. Наконец, Т-клетки должны быть активизированы и пролиферирующих потому что ретровирус может только заразить активно делящихся клеток.
Метод, представленный здесь для получения антиген-специфических Т-клеток имеет ряд ограничений. Во-первых, трудно достигать 100% эффективностью трансдукции для первичной мыши Т-клеток. Часть клетки не экспрессируют TCR интересов. Во-вторых, трансдуцированных TCR α и β цепи могут mispair с эндогенными ТКО 9, что может снизить уровень экспрессии TCR интересов. Кроме того, mispaired ТКО может вызвать аутоиммунные в естественных условиях 11. Наконец, есть только ограниченные сроки трансдуцированных Т-клетки могут быть использованы. Примерно через одну неделю, клетки подвергаются апоптозу, если повторной стимуляции. Тем не менее, клетки могут стать исчерпаны, и терять функций повторный запуск раздражениями.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами NIH (5U01CA137070) и Американского онкологического общества (RSG-09-070-01-LIB), Научно-исследовательский институт рака Следователь премии (MK), Американской ассоциации сердца предварительно докторских стипендий (КМ) и испанского Министерства образования и науки стипендий (ПНГ).
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Николая Restifo и д-р Ю. Zhiya (NIH / НИР) за полезные предложения к протоколу.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | ||
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | ||
Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | ||
1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | ||
Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | ||
Recombinant human IL2 | Peprotech | 200-02 | ||
Anti-CD3e antibody | BD Bioscience | 553057 | ||
Anti-CD28 antibody | BD Bioscience | 553294 | ||
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | ||
OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | ||
10cm Poly-lysine coated plates | BD Bioscience | 356469 | ||
pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | ||
Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | ||
DMEM | Invitrogen | 12491-023 | ||
FBS | Hyclone | SH3008803 | ||
Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | ||
L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | ||
Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | ||
Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | ||
RPMI | Invitrogen | 12633-020 | ||
β- Mercaphoethanol | Invitrogen | 21985-023 |
Media:
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid).
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep).
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaphoethanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate).