ミクロ熱対流を使用して迅速なPCRの熱サイクル

Summary

我々は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を経由してDNA複製を実行する新規な方法を説明します。熱対流は、一定温度で反応器の対向面を維持することによって、変性アニーリング、および拡張子の条件の間に連続してシャトルの試薬に活かされている。この本質的にシンプルなデザインは、迅速なPCRをよりアクセシブルにすることを約束。

Abstract

多くの分子生物学的アッセイは、検出可能な濃度レベルに最初に希薄な標的DNAサンプルを増幅するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に何らかの形で依存する。しかし、従来のPCRの熱サイクルのハードウェアの設計は、主にその温度の熱電ヒーターによって調節され、深刻な達成可能な反応速度^1を制限する大規模な金属製の加熱ブロックに基づく。かなりの電力は、ポータブルな形式でこれらの機器を展開する能力を制限し、繰り返し試薬の混合物を加熱し、冷却するために必要です。

熱対流は、これらの制限の^2-9を克服する可能性を秘めている有望な代替の熱サイクルアプローチとして浮上している。対流フローは、地球の大気、海洋、そしてインテリアから、装飾的でカラフルな溶岩のランプに至るまでの設定の多様な配列では日常茶飯事です。流体の運動は、各ケースで同じ方法で開始されます。浮力駆動型不安定性は、流体の閉じ込めボリュームが空間的な温度勾配にさらされている場合に発生します。これらの同じ現象はPCR熱サイクルを実行するための魅力的な方法を提供します。適切に設計された原子炉の形状全体の静的温度勾配​​を適用することにより、連続的な循環流を繰り返し、変性、アニーリングおよび反応（図1）の拡張の段階に関連する温度帯によってPCR試薬を輸送することを確立することができます。熱サイクルは、したがって、完全に繰り返し加熱し、楽器を冷却する必要がなくなり、単に一定の温度で2つの対向面を保持することによって疑似等温的に作動させることができる。

対流サーモサイクラーの設計が直面する主な課題の一つは、試薬が順次時間^10,11の十分な期間、適切な温度帯を占有することを保証するために原子炉内空間速度と温度分布を正確に制御する必要がありますされています。ここでは、マイクロスケール対流サーモサイクラー¹²でフル3次元速度と温度分布を調べるために我々の努力の成果を説明。突然、私たちは最適な温度プロファイルの完全な範囲をサンプリングするための試薬のための強化の機会を提供する流路の間で（1）継続的な交流の相乗組み合わせによるPCRのために非常に有利な複雑な流れの軌道の一部を発見、としている（ 2）増加時間は、拡張温度ゾーン内のPCRのレート制限ステップを過ごした。非常に迅速なDNAの増幅時間は（10分未満）、これらのフローを生成するように設計された原子炉で達成可能です。

Protocol

1。対流サーモの基本設計我々は、その温度が独立して（図2）7を制御される2つのアルミニウム板に挟まれている交換可能なプラスチック製の反応室"カートリッジ"から構成されるシンプルな対流熱サイクル装置を構築した。 円筒型反応器の井戸は、穴径と希望のアスペクト比（高さ/直径= H / D）を実現するために採用プラスチックシートの厚さの異なる組み合わせで、ポリカーボネートブロックの穴の加工配列で埋め込 ​​まれています。二つの異なる原子炉の形状は、ここに示された結果では考慮されています：H / D = 9：H = 15.9ミリメートル、D = 1.75ミリメートル、38.2μLボリューム、H / D = 3：H = 6.02ミリメートル、D = 1.98ミリメートル、18.5μLボリューム。 原子炉の底部表面はmicroprocesser駆動型温度コントローラとインタフェースするカートリッジヒーターを含むアルミブロックを使用して加熱される。 原子炉の上面の温度は循環水浴に接続されているアルミブロックを使用して調節されている。 アセンブリ全体は、対向アルミブロックの間の熱伝導を制限するために、ナイロンのネジを使用して、一緒にクランプされます。 2。 PCR反応混合物の調製とローディング典型的な100μL反応混合物は、10 ×緩衝液の10μL、25 mMのMgCl 2、dNTPの10μL（2 mMの各）6μL、DI水、β-アクチンプローブ、βの10μLの10μLの41.2μLを含んでいます-アクチンフォワードプライマー、β-アクチンのリバースプライマーの10μL、ヒトゲノム鋳型DNA（10 ng /μLの）2μLおよびKOD DNAポリメラーゼ（2.5単位/μL）0.8μL。 試薬をロードする前に、アルミテープの薄いシートを用いてPCRチャンバの底部表面をシール。 レイン- Xアンチフォグが続くウシ血清アルブミン10 mg / mLの水溶液で原子炉ウェルを洗浄します。 長いゲルローディングピペットチップを使用し、FEPテフロンテープで上面をシール原子炉ウェルにピペットで試薬。 3。対流サーモで反応を実行する希望の上側と下側表面の温度に反応、予熱アルミブロックの両方を開始する前に。 サンドイッチは、プラスチック製の原子炉はアルミの加熱ブロック間のPCR試薬をロード、そして迅速にナイロンネジを使用して、一緒にアセンブリをクランプする。 反応は、所望の時間のために進行した後に、ヒーターのスイッチをオフにし、急速にそれを冷却し、対流を停止するには冷やした金属ブロックの上にデバイスの下側（ホット）表面に置きます。 プラスチック製の原子炉を取り外し、その後の分析のための井戸（長いゲルローディングチップを使用して）から製品をピペット。 4。ゲル電気泳動分析の実行溶液が透明になるまで攪拌しながらホットプレート上で1 ×バッファー500mlでアガロース10gを加熱することにより、2重量％アガロースゲルを準備します。 キャスティングトレイにアガロースゲルをロードし、コームを挿入する。 〜30分間ゲルをセットしてみましょう。 櫛を削除し、ゲルが水没するまで、1 × TAEバッファーを添加します。 蛍光染色したDNAサンプルは、2μL100 × SYBRグリーンI溶液、2μLのDNAサンプルを、2μL6Xオレンジローディング色素、及び4μLのTAE緩衝液が含まれています。 ウェルにDNAサンプルを追加し、マーカーのサイズを設定する100 bpのDNAラダーで1時間60 Vでの分離を実行します。 ゲルを取り出して、結果を得るために、UV光の下でそれを撮影する。 5。代表的な結果： 対流サーモサイクラーの最適設計は、PCRプロセスに関与する主要な温度によって試薬を輸送することができる循環流を生成する正しい反応器形状を選択、。ここで考えている円筒状の炉に変化させることができる幾何学的パラメータは、高さ（H）と直径（D）、または同等のアスペクト比（H / D）です。我々は、数値流体力学（CFD）を使用して、異なるアスペクト比の範囲で対流PCR反応装置内部の3次元流れ場を検討し、予想外に複雑なパターンが生じることを見出した。さらに重要なことは、我々の分析では有意に反応12加速これらの複雑な流れ場の一部を明らかにした。 これらの幾何学的効果が明らかに高く、低アスペクト比で反応器における流れ場を比較することによって見ることができます。高アスペクト比の場合（H / D = 9、背が高く、細い円柱）、流体要素は本質的にループを閉じているパスをトレースする軌道に沿って移流され、そして彼らは長時間、同じパスに従うようにロックインです。時間（図3a）。したがって、fの間の交換のための少し機会があるPCR（アニーリングおよび原子炉の上部と下部の表面に極端な変性の間で振動する）と（中心に近いローカライズ増幅に寄与していない残りの軌道のはるかに大きいアンサンブルのための温度条件の最適な順序に試薬を公開する低軌道原子炉の）。 流体要素の軌跡は、もはや閉じたパス（図3b）に従うという意味で、より混沌となって、、流れ場が小さく、アスペクト比（短く、広い円柱H / D = 3）で大きく異なっています。このように、試薬がより複雑な温度プロファイルにさらさ​​れていても、流体要素は、試薬量のより多くの、最適な温度プロファイルを体験する機会を持つように軌道のはるかに広い範囲を探索することができます。これらの結果は反しH / D在学中の個々の流れの軌跡が= 9が温度プロファイルを生成することにより、PCRのために有利なように見えることを示唆していること、従来のサーマルサイクラー、/ hで流れ場のカオス的性質に用いられるものと同様の"外観" D = 3、最終的には試薬は非常に長いために不利な軌道に閉じ込められることがないよう強化された交流を促進することにより、グローバル規模で支配する。 この仮説を検証し、原子炉の形状は​​、PCRのためのより有利であったかを判断するために、我々は、人間のゲノムDNAテンプレートからのβ-アクチン遺伝子に関連付けられている295 bpのターゲットのPCR複製を実行するために、それらの両方を使用していました。検出可能な製品を前に少なくとも20分必要となる同じ反応はH / D = 9（図4b）で観察された驚くべきことに、我々は日常的に、H / D = 3（図4a）でわずか10分で正しいターゲット製品の増幅を達成。反応特異性は、複数の非特異的な製品はH / D = 9ここで、流れ場のトラップを長時間不利な熱軌道内の流体要素で生成される一方、単一のPCR産物が、得られる= 3 時間/ dでもはるかに大きいです。 図1。上部と下部の表面異なる固定温度で維持されている円筒状のチャンバー内の熱対流。底面の温度が上部よりも高い場合、垂直方向の密度勾配は、循環流のパターンを生成することが可能な密閉型流体内に確立されます。幾何学的パラメータの正しい選択（ 高さhと直径D）と、対流の流れ場は、上部と下部の表面は（重力が垂直下方に作用する）をそれぞれ、アニーリング温度や変性近くmanintainedされているPCRの熱サイクルを作動させるために活かしたことができます。 図2（）対流PCR thermocylerのキーコンポーネント。原子炉のカートリッジは、円筒状のチャンバーの配列を含むポリカーボネートブロックで構成されています。ブロックは循環水浴と埋め込まれたヒーターを組み込んだ底板に接続するように設計されたトッププレートの間に挟まれている。 （B）PCRの試薬 ​​は装置が反応を行うために組み付けた後に、ロードされ、原子炉のカートリッジ内に封入されています。完了すると、procuctsは簡単に、その後の分析のために出ピペッティングすることができます。 図3。53および96の温度と円筒形の炉の内部で生成した3次元対流場の計算機シミュレーション° Cそれぞれ、上面及び下面に課される。結果は、（a）H / D = 9（38.2μL反応器容積）と（b）H / D = 3（18.5μL反応器容積）のアスペクト比で表示されます。三次元流れ場を通過する流体要素に続いて代表の軌跡は、トップとパスの側面図の投影と一緒に左に表示されている、流体要素は、次の温度対時間の対応するプロットは、右側に表示されています。 H / D = 9時の熱プロファイルは、従来のサーマルサイクラーに近いように見えますが、H / D = 3における混沌とした流れ場では、PCRに反し、より有利で ​​す。 図4 DNAの複製図3（表面はそれぞれ、53および96 ° Cに維持された上部および下部）に示すように原子炉のジオメトリで得られた結果。 （A）PCRは、大幅に反応時間がわずか10分（100 bpのラダー、レーン1-4：4つの異なる円筒状のチャンバー内での並列反応から製品M）の後に目に見える強力な副生成物として明らかに、H / D = 3で加速される。 （B </strオング>）（M見える製品が観察される前に、H / D = 9で実行した時と同じ反応は、少なくとも20分を必要とし、複数のバンドは、所望の生成物に加えて、非特異的な標的DNAの明らか示す複製です：100 bpのラダー、レーン1-2：異なる2つの円筒状のチャンバーでパラレル反応の製品）。

Discussion

流れと化学反応の相互作用は、カオス的移流の影響を受けて大幅に変更することができます。しかし、これらの複雑な流れの状態は、特に3Dの効果が重要になって現実的なジオメトリで、勉強に挑戦しています。レイリーベナール対流は、H / D> 1だけでなく、これらの現象を探索するのに便利なプラットフォームを提供で、PCRを行うために、そのアプリケーションはまた、プローブする流れと化学反応との間の結合が可能になります。このユニークな機能により、DNA複製の速度を加速する混沌とした効果行為（反し）最適なフローの状態を選択することが可能になります。

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
KOD DNA Polymerase kit		Novagen	71085-3
TaqMan β-actin Control Reagents kit		Applied Biosystems	401846
Aluminum tape		Axygen, Inc.	PCR-AS-200
Bovine serum albumin		Sigma-Aldrich	A2153
Rain-X Anti-Fog		SOPUS Products
Long Gel-loading Pipette Tips		Fisher Scientific	05-408-151
FEP Teflon tape		McMaster-Carr	7562A17
Agarose gel		Bio-Rad	161-3107
TAE running buffer		Bio-Rad	141-0743
SYBR Green I		Invitrogen/Molecular Probes	S7563
6x Orange Loading Dye		Fermentas	R0631
100 bp DNA ladder sizing marker		Bio-Rad	170-8202