Быстрые ПЦР термоциклирования использованием Микромасштабные тепловой конвекции

Summary

Мы описываем новый метод для выполнения репликации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Тепловая конвекция запряженных постоянно курсируют между реагентами денатурации, отжига и расширение условий путем поддержания противоположных поверхностях реактора при постоянной температуре. Это по своей сути простая конструкция обещает сделать быстрый ПЦР более доступной.

Abstract

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed¹. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.

Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations^2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth’s atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.

One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time^10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers¹². Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

Protocol

1. Основные Дизайн Конвективный Термоциклер Мы построили простую конвективного термоциклирования устройство, состоящее из взаимозаменяемых пластиковых реакционной камере "патроны", которые зажаты между двумя алюминиевыми пластинами которого температура независимо управляемых 7 (рис. 2). Цилиндрические скважин реактора встроенных массивов путем механической обработки отверстий в блоках поликарбоната, с различными комбинациями диаметра отверстий и пластик толщиной листа, используемых для достижения желаемого соотношения сторон (высота / диаметр = / г). Два разных геометрии реактора рассматриваются в представленных здесь результатов: в / г = 9: ч = 15,9 мм, D = 1,75 мм, 38,2 мкл объема; / г = 3: А = 6,02 мм, D = 1,98 мм, 18,5 мкл объема. Нижняя поверхность реактора нагревается использованием алюминиевого блока, содержащего картриджа нагреватели сопряжена с microprocesser приводом контроллером температуры. Температура на верхней поверхности реактора регулируется использование алюминиевый блок связан с циркуляцией водяной бане. Вся сборка зажимают вместе с помощью нейлоновой винты для ограничения тепловой проводимости между противостоящими блоками алюминия. 2. Подготовка и загрузка реакционной смеси ПЦР Типичный 100 мкл реакционной смеси содержит 10 мкл 10x буферный раствор, 6 мкл 25 мМ MgCl 2, 10 мкл дНТФ (2 мм каждая), 41,2 мкл DI воды, 10 мкл β-актина зонд, 10 мкл β -актина прямого праймера, 10 мкл β-актина обратного праймера, 2 мкл геномной ДНК человека шаблонов (10 нг / мкл) и 0,8 мкл KOD ДНК-полимеразы (2,5 ед / мкл). Перед загрузкой реагентами, печать нижней поверхности камеры ПЦР, используя тонкий лист алюминиевой лентой. Промыть реактора скважин с 10 мг / мл водного раствора бычьего сывороточного альбумина следует Дождь-X Anti-Fog. Внесите реагентов в реактор скважин с использованием длинных гель загрузкой наконечники для пипеток и печатью верхней поверхности с лентой FEP Teflon. 3. Запуск реакции в конвективной Термоциклер Перед началом реакции, подогрева обоих блоков алюминия до желаемого верхней и нижней температуры поверхности. Сэндвич пластиковый реактор загружается с ПЦР реагентов между блоками алюминия отопления, и быстро зажим сборки вместе с помощью нейлоновой винтов. После реакция продолжалась заданное время выключить обогреватели и место ниже (горячей) поверхности устройства в верхней части охлажденного металлического блока, чтобы быстро охладить его и остановить конвективного потока. Удалите пластиковую реактора и пипетки продуктов из скважин (с помощью советов долго загрузки гель) для последующего анализа. 4. Выполнение анализа гель-электрофореза Подготовка 2 мас% агарозном геле при нагревании 10 г агарозы 500 мл 1x буфер на перемешивание плитке, пока раствор не станет ясно. Нагрузка на агарозном геле в литье лоток и вставьте расческу. Пусть гель набор для ~ 30 мин. Удалите гребенку и добавить 1x TAE буфер, пока гель погружен в воду. Флуоресцентно окрашенных образцов ДНК содержат 2 мкл 100x SYBR Green I решение, 2 мкл образца ДНК, 2 мкл 6x Загрузка оранжевая краска, и 4 мкл буфера ТАЕ. Добавить образцы ДНК в лунки и запустить разделения при 60 В в течение 1 ч с 100 б.п. ДНК маркер лестнице размеров. Удалить гель и сфотографировать его под ультрафиолетовым светом, чтобы получить результат. 5. Представитель Результаты: Оптимальное проектирование конвективных thermocyclers входит выбор правильной геометрии реактора, который будет генерировать поток кровообращения способен перевозить реагентов через ключ температур, участвующих в процессе ПЦР. Геометрических параметров, которые можно варьировать в цилиндрических реакторах рассматриваемые здесь высота (H) и диаметра (D), или, что эквивалентно соотношение сторон (в / г). Мы изучили 3-D поток поля внутри конвективного ПЦР реакторы в диапазоне разными пропорциями использованием вычислительной гидродинамики (CFD), и неожиданно обнаружили, что сложные структуры могут возникнуть. Более того, наш анализ обнаружил подмножество этих сложных полей потока, что значительно ускорит реакцию 12. Эти геометрические эффекты могут быть ясно видно из сравнения поля течений в реакторах при высоких и низких пропорциями. В случае высокой пропорции (в / г = 9; высокий, тощий цилиндр), жидкость элементы переносимой вдоль траекторий трассировки из путей, которые в основном замкнутые петли, а они заблокированы в следовать тем же путям в течение длительного периода времени (рис. 3а). Следовательно, существует мало возможностей для обмена между енизкой траектории, которые предоставляют реагентов для оптимальной последовательности тепловые условия для ПЦР (колеблется между отжигом и денатурирующих крайности в верхней и нижней поверхностях реактора) и намного больше, ансамбль остальные траектории, которые не вносят вклад в усиление (локализованные ближе к центру из реактора). Поля течения сильно отличается в меньшую соотношение сторон (в / г = 3; короче, шире цилиндр), становится все более хаотическим в смысле, что жидкость траектории элемент больше не следовать замкнутых путей (рис. 3б). Таким образом, хотя реагентов подвергаются более сложным профилем температуры, жидкость элементы в состоянии исследовать гораздо более широкий спектр траекторий, чтобы большая часть реагента объем возможность испытать оптимальный тепловой профилей. Эти результаты позволяют предположить, что counterintuitively в то время как индивидуальных траекторий потока на ч / д = 9 может оказаться более благоприятным для ПЦР, создавая профили температуры, что "смотреть" аналогичные тем, которые применяются в обычных амплификаторе, хаотичности поля течения в ч / D = 3 в конечном счете, доминирует в глобальном масштабе путем поощрения расширения обмена, так что реагенты не попасть в ловушку неблагоприятной траектории очень долго. Чтобы проверить эту гипотезу и определить, какой реактор геометрия была более благоприятной для ПЦР, мы использовали оба они для выполнения ПЦР репликации 295 б.п. целевой связанные с β-актина ген человеческой геномной ДНК-матрицы. Примечательно, что мы обычно достигается усиление правильного целевого продукта всего за 10 мин при ч / г = 3 (рис. 4а), в то время как такая же реакция требуется не менее 20 мин до обнаружены продукты наблюдались при H / D = 9 (рис. 4, б) . Реакция специфичность и намного больше при в / г = 3, где один продукт ПЦР получается, а несколько неспецифические продукты образуются при / г = 9, где поля течения жидкости ловушки элементов в неблагоприятных тепловой траекторий в течение длительных периодов времени. Рисунок 1. Тепловая конвекция в цилиндрическую камеру, в которой верхняя и нижняя поверхности поддерживается на различных фиксированных температурах. Если температура на нижней поверхности выше, чем в верхней части, вертикальный градиент плотности устанавливается в закрытых жидкость, которая способна генерировать модель кровеносной потока. При правильном выборе геометрических параметров (высота и диаметр ч г), конвективного потока поля может быть использован для приведения в действие ПЦР термоциклирования, когда верхняя и нижняя поверхности manintained возле отжига и денатурирующих температур, соответственно (гравитация действует вертикально вниз). Рисунок 2. (А) Ключевые компоненты конвективного потока ПЦР thermocyler. Реактор картридж состоит из блока поликарбоната, содержащую массив цилиндрических камер. Блок зажат между верхней пластиной предназначен для подключения к циркулирующим водяной бане и нижней пластины с встроенными обогревателями. (Б) ПЦР реагентов загружены и опечатаны внутри реактора картридж, после чего устройство собирается выполнять реакции. После завершения procucts может быть легко из пипетки для последующего анализа. Рисунок 3. Вычислительного моделирования 3-D конвективного потока поля, генерируемые внутри цилиндрических реакторов с температурой 53 и 96 ° С, введенные в верхней и нижней поверхности, соответственно. Результаты представлены в пропорции: (а) / г = 9 (38,2 мкл объема реактора) и (б) / г = 3 (18,5 мкл объема реактора). Представитель траектории следуют элемента жидкости, проходящего через 3D поле течения показана на левой вместе с верхней и боковой вид проекции пути; Соответствующий график зависимости температуры от времени после элемента жидкости показано на рисунке справа. Тепловой профиль на ч / д = 9 представляется близкой к обычным амплификаторе, но хаотическое поле течения в в / г = 3 counterintuitively более благоприятным для ПЦР. Рисунок 4. Репликации ДНК результатов, полученных в реакторе геометрии показано на рисунке 3 (верхней и нижней поверхностей сохранились на 53 и 96 ° C, соответственно). () ПЦР значительно ускоряется при / г = 3, как это видно на сильные продукты виден после всего лишь 10 минут время реакции (M: 100 б.п. лестницы, дорожки 1-4: изделия из параллельных реакций в 4 различных цилиндрических камер). (Б </strонг>) такая же реакция осуществляется на ч / д = 9 требует, по крайней мере 20 минут до видимых продуктов не наблюдается, и несколько полос очевидно указывает репликации неспецифической ДНК-мишени, в дополнение к целевой продукт (M: 100 б.п. лестнице, 1-2 полосы: изделия из параллельных реакций в 2 различных цилиндрических камер).

Discussion

Взаимодействие между потоком и химической реакции может резко измениться под влиянием хаотической адвекции. Но эти сложные состояния потока являются сложными для изучения, особенно в реалистичные 3D геометрии, где эффекты становятся существенными. Рэлея-Бенара в в / г> 1, не только предоставляет удобную платформу для изучения этих явлений, их применение для выполнения ПЦР позволяет также связь между потоком и химических реакций на прощупываться. Эта уникальная возможность позволяет выбрать оптимальные состояния течения, где хаотические действия эффектов (counterintuitively) ускорить скорость репликации ДНК.

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
KOD DNA Polymerase kit		Novagen	71085-3
TaqMan β-actin Control Reagents kit		Applied Biosystems	401846
Aluminum tape		Axygen, Inc.	PCR-AS-200
Bovine serum albumin		Sigma-Aldrich	A2153
Rain-X Anti-Fog		SOPUS Products
Long Gel-loading Pipette Tips		Fisher Scientific	05-408-151
FEP Teflon tape		McMaster-Carr	7562A17
Agarose gel		Bio-Rad	161-3107
TAE running buffer		Bio-Rad	141-0743
SYBR Green I		Invitrogen/Molecular Probes	S7563
6x Orange Loading Dye		Fermentas	R0631
100 bp DNA ladder sizing marker		Bio-Rad	170-8202