Descriviamo un metodo per preparare organotipica fettine di ippocampo che può essere facilmente adattato ad altre regioni del cervello. Sezioni di cervello sono previste sulle membrane porose e terreni di coltura è consentito costituiscono l'interfaccia. Questo metodo consente di mantenere l'architettura lordo dell'ippocampo per un massimo di 2 settimane in cultura.
L'ippocampo, un componente del sistema limbico, gioca un ruolo importante nella memoria a lungo termine e la navigazione spaziale 1. Neuroni dell'ippocampo può modificare la forza delle loro connessioni, dopo brevi periodi di forte attivazione. Questo fenomeno, noto come potenziamento a lungo termine (LTP), può durare per ore o giorni ed è diventato il meccanismo miglior candidato per l'apprendimento e la memoria 2. Inoltre, l'anatomia ben definito e connettività dell'ippocampo 3 ha fatto un sistema modello per lo studio classico trasmissione sinaptica e 4 plasticità sinaptica.
Come la nostra comprensione della fisiologia delle sinapsi dell'ippocampo crebbe e giocatori molecolare è stato identificato, la necessità di manipolare proteine sinaptiche è diventato un imperativo. Organotipica culture dell'ippocampo offrono la possibilità di manipolazione genetica facile e preciso l'intervento farmacologico, ma mantenere l'organizzazione sinaptica che è fondamentale per comprendere la funzione sinapsi in un contesto più naturalistico di routine cultura metodi dissociato neuroni.
Qui vi presentiamo un metodo per la preparazione e la cultura fettine di ippocampo, che può essere facilmente adattato ad altre regioni del cervello. Questo metodo permette di raggiungere facilmente le fette di manipolazione genetica utilizzando approcci diversi, come infezioni virali o 5,6 biolistics 7. Inoltre, fette può essere facilmente recuperato per le analisi biochimiche 8, o trasferiti ad microscopi per l'imaging 9 o esperimenti elettrofisiologici 10.
Questo metodo si basa sul primo metodo descritto da Stoppini et al. 11 e offre un modo rapido a fette cultura dell'ippocampo. L'aspetto più importante di questo protocollo è quello di mantenere fette sterile, quindi è fondamentale utilizzare appropriate tecniche sterili e per disinfettare correttamente e sterilizzare tutto il materiale a contatto con il tessuto.
Diverse fonti sieri possono influenzare la qualità delle fette. Si consiglia di provare diversi lot…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal NINDS – NIH R01NS060756
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | ||
6 well plates | BD Falcon | 353046 | ||
Tissue Slicer | Stoelting | 51425/51415 | ||
Microscope | Olympus | SZX7-ILLD2-100 | ||
Hippocampus dissecting tool | F.S.T | 10099-15 | ||
Large utility scissors. Perfection | F.S.T | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | ||
Iris Spatula | F.S.T | 10093-13 | ||
Straight spatula | F.S.T | 10094-13 | ||
Rounded spoon micro spatula | VWR | 57949-039 | ||
Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Science | 72946 | ||
Dissecting tweezers | Dummont | #2 | ||
Small dissecting scissors | F.S.T | 14060-10 | ||
MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | ||
Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | ||
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | ||
CaCl2 (1 M) | Sigma | C3881 | ||
MgSO4 (1 M) | Sigma | M2773 | ||
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma | I0516 | ||
Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma | A4544 | ||
D-Glucose | Sigma | G5767 | ||
NaHCO3 | Sigma | S6014 | ||
Hepes | Sigma | H7523 | ||
Sucrose | Sigma | S5016 | ||
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma | P0290 | ||
KCl | Sigma | P3911 | ||
MgCl2 (1 M) | Sigma | M9272 |