β细胞死亡介导细胞毒性T淋巴细胞的方法来评估
Summary
细胞介导的淋巴细胞毒（CML）的检测，可用于测试自身反应性的反应，并在体外研究细胞死亡的机制。然而，利用活细胞共聚焦显微成像技术与荧光染料，类型和细胞死亡以及途径利用动力学可以更详细的研究。
Abstract
1型糖尿病（T1D）是一种T细胞介导的自身免疫性疾病。期间发病，患者会逐渐变得更insulinopenic胰岛素生产丢失，想必这胰腺β细胞的杀伤性T细胞的结果。 T1D发展过程的了解β细胞死亡的机制提供见解产生本病的有效的治疗方法。细胞介导的淋巴细胞毒（CML）的检测在历史上所使用的放射性核素铬51（51铬）标记的靶细胞。这些目标都暴露在效应细胞和靶细胞释放51班读淋巴细胞介导的细胞死亡的迹象。抑制剂细胞死亡减少51铬释放的结果。
作为效应细胞，激活自身反应性克隆人口的CD8 +细胞毒性T淋巴细胞（CTL）从鼠标股票转基因为AI4 T细胞受体（TCR）的α和β链隔离。 AI4激活T细胞，51铬标记的目标为16小时的NIT细胞共同培养， 释放 51铬记录来计算具体的裂解
在许多重要的生理活动，如能源生产，调节信号转导，细胞凋亡，线粒体参与。 β细胞线粒体功能的改变在T1D发展的研究是一个新的领域的研究。利用线粒体膜电位的染料甲基若丹明甲酯（TMRM）和共聚焦显微镜活细胞成像，我们监测随着时间的推移在β细胞系NIT – 1的线粒体膜电位。对于影像学检查，效应AI4 T细胞标记的荧光核染色染料Picogreen。 NIT – 1细胞和T细胞共培养，在墓室玻璃罩，并安装在一个活细胞室配备显微镜阶段，控制在37 ° C，5％的CO 2和加湿。在这些实验中的图像，每个群集为400分钟，每3分钟。
超过400分钟的过程中，我们观察到的NIT – 1细胞AI4 T细胞连接集群中的线粒体膜电位的耗散。在NIT – 1细胞共培养与MHC的同步控制实验MIS匹配的人体淋巴细胞Jurkat细胞，线粒体膜电位保持完好。这种技术可以用来观察在受到攻击的细胞毒性淋巴细胞，细胞因子或其他细胞毒性试剂的细胞线粒体膜电位的实时变化。
Protocol
Discussion
细胞毒性T细胞介导的β细胞的死亡是主要的病理生理 T1D 5。允许我们使用51铬释放的慢性粒细胞白血病实验研究的效靶反应 6程度。然而，T细胞介导的β细胞死亡的详细过程和途径仍然不能完全理解。由于线粒体是β细胞功能和死亡7的关键，我们专注于线粒体的变化，在视觉慢性粒细胞白血病。线粒体膜电位的耗散是一个早在导致细胞凋亡 8的线粒体功…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由来自美国国立卫生DK074656和AI56374（CEM）研究院的资助，以及青少年糖尿病研究基金会的支持。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
Referenzen
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