Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos
Summary
Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.
Abstract
Diabetes tipo 1 (DM1) é uma doença mediada por células T auto-imunes. Durante a patogênese, os pacientes tornam-se progressivamente mais insulinopenic como a produção de insulina está perdido, presumivelmente, o que resulta da destruição das células beta pancreáticas pelas células T. Compreensão dos mecanismos de morte das células beta durante o desenvolvimento do DM1 irá fornecer informações para gerar uma cura eficaz para esta doença. Mediada por células linfocitotoxicidade (CML) ensaios têm historicamente utilizado o Chromium radionuclídeos 51 (51 Cr) para rotular as células-alvo. Estas metas são, em seguida, expostos a células efetoras e da liberação de 51 Cr a partir de células-alvo é lido como uma indicação de linfócitos mediada por morte celular. Inibidores de resultado morte celular na liberação diminuída de 51 Cr.
Como células efetoras, usamos uma população autoreactive ativado clonal de linfócitos CD8 + T citotóxicas (CTL) isolado de um camundongo transgênico estoque para ambas as cadeias alfa e beta do receptor de células T AI4 (TCR). Ativado AI4 células T foram co-cultivados com células-alvo 51 Cr rotulados NIT por 16 horas, a liberação de 51 Cr foi gravado para calcular a lise específica
Mitocôndrias participar em muitos eventos fisiológicos importantes, como a produção de energia, regulação da transdução de sinalização e apoptose. O estudo da célula beta mitocondrial alterações funcionais durante o desenvolvimento do DM1 é uma área nova de pesquisa. Usando o potencial de membrana mitocondrial corante Rodamina Tetrametil Methyl Ester (TMRM) e imagens de células microscópicas confocal vivemos, nós monitorados potencial de membrana mitocondrial ao longo do tempo na linha da célula beta NIT-1. Para exames de imagem, AI4 células T efectoras foram marcadas com o corante fluorescente coloração nuclear Picogreen. NIT-1 e células T foram co-cultivados em câmaras lamínula e montado sobre o palco microscópio equipado com uma câmara de células vivas, a 37 ° C, com 5% de CO 2, e umidificado. Durante esses experimentos imagens foram tiradas de cada cluster a cada 3 minutos para 400 minutos.
Mais de um curso de 400 minutos, observou-se a dissipação do potencial de membrana mitocondrial em NIT-1 grupos de células, onde AI4 células T foram anexados. No experimento controle simultâneo onde NIT-1 as células foram co-cultivados com MHC desencontradas células Jurkat linfócitos, potencial de membrana mitocondrial permaneceu intacta. Esta técnica pode ser usada para observar em tempo real as mudanças no potencial de membrana mitocondrial em células sob ataque de linfócitos citotóxicos, citocinas, ou outros reagentes citotóxicos.
Protocol
Discussion
Citotóxica de células T morte celular mediada beta está a fisiopatologia das principais DM1 5. CML ensaios utilizando 51 Cr lançamento nos permitem estudar o grau de meta-efetoras de resposta 6. No entanto, o processo detalhado e os caminhos da morte das células T mediada por células beta ainda não é totalmente compreendido. Uma vez que as mitocôndrias são críticos para a função das células beta ea morte 7, centrada em mudanças mitocondrial durante a CML visual….
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde e DK074656 AI56374 (CEM), bem como o Juvenile Diabetes Research Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
Referenzen
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