Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária
Summary
Carcinoma associado fibroblastos (FAC) rico em miofibroblastos presentes no estroma tumoral, desempenhar um papel importante na condução de progressão do tumor. Nós desenvolvemos um modelo coimplantation xengraft tumor para gerar FAC experimentalmente a partir de fibroblastos humanos mamária. O protocolo descreve como estabelecer miofibroblastos CAF que adquirem uma capacidade de promover tumourigenesis.
Abstract
Os carcinomas são tecidos complexo composto de células neoplásicas e um compartimento não-cancerosas referido como o 'estroma'. O estroma é composto de matriz extracelular (ECM) e uma variedade de células mesenquimais, incluindo fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliais, pericitos e leucócitos 1-3.
O estroma tumoral associado é sensível a sinais de substancial parácrinos liberados por células de carcinoma vizinhos. Durante o processo da doença, o estroma, muitas vezes torna-se povoado por carcinoma-associada fibroblastos (FAC), incluindo um grande número de miofibroblastos. Estas células foram previamente extraído de diversos tipos de carcinomas humanos para a cultura in vitro. A subpopulação de FAC é distinguível através da sua sobre-regulação de α-actina de músculo liso (α-SMA) expressão 4,5. Essas células são uma característica da 'fibroblastos ativados "que compartilham propriedades semelhantes com miofibroblastos commonly observado em tecidos lesados e fibrótico 6. A presença desse grupo CAF miofibroblástica é altamente relacionada com alto grau de malignidade e associado com prognósticos pobres em pacientes.
Muitos laboratórios, inclusive o nosso, têm mostrado que FAC, quando injetados com células de carcinoma em ratos imunodeficientes, são capazes de promover substancialmente tumourigenesis 7-10. FAC preparados a partir de pacientes com carcinoma, no entanto, freqüentemente sofrem senescência durante a propagação da cultura limitar a extensão da sua utilização em toda a experimentação em curso. Para superar esta dificuldade, desenvolvemos uma nova técnica para gerar experimentalmente imortalizado mamárias humanas linhas celulares CAF (exp-FAC) de fibroblastos humanos mamária, utilizando um modelo de mama coimplantation xenoenxerto tumor.
A fim de gerar exp-FAC, parental humano fibroblastos mamárias, obtidas a partir do tecido mamoplastia de redução, foram os primeiros immortalised com hTERT, a subunidade catalítica da telomerase holoenzima, e projetados para expressar um gene GFP e resistência puromicina. Essas células foram coimplanted com células MCF-7 de carcinoma de mama humano expressando um oncogene ras ativados (MCF-7-ras células) em um xenoenxerto mouse. Após um período de incubação in vivo, inicialmente injetados fibroblastos humanos mamária foram extraídos do xenoenxertos tumor com base em sua resistência puromicina 11.
Observamos que o residente de fibroblastos humanos mamárias têm diferenciada, adotando um fenótipo miofibroblástica e adquirida tumor propriedades promotoras durante o curso da progressão do tumor. Importante, essas células, definidas como exp-FAC, imitam de perto o fenótipo do tumor de promoção miofibroblástica da FAC isolado de carcinomas de mama de pacientes dissecados. Nosso tumor xenoenxerto derivados exp-FAC, portanto, fornecer um modelo eficaz para estudar a biologia da FAC em Breas humanacarcinomas t. O protocolo descrito também pode ser estendido para a geração e caracterização de populações de vários CAF derivados de outros tipos de carcinomas humanos.
Protocol
Discussion
A falta de marcadores específicos CAF e do nível de heterogeneidade observada entre FAC tornar a caracterização deste tipo de célula um desafio em si mesmo. FAC estudar in vitro também tem sido dificultada pela complicação adicional de que essas células senesce e parar de proliferar quando cultivadas por um longo período. Nossa tentativa anterior de imortalizar diretamente FAC primário usando uma construção hTERT retroviral cDNA foi vencida. Portanto, para investigar o tumor promover propriedades d…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) para apoio generoso e supervisão deste trabalho e Kieran Mr. Mellody (University of Manchester, Manchester) para a edição crítica deste manuscrito. Este projecto foi apoiado pela Research UK (CR-UK) conceder número C147/A6058 (AO)
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | ||
| Fetal calf serum | GIBCO | 10270 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Collagenase type I | Sigma | C0130-1G | ||
| hyaluronidase | Sigma | H4272 | ||
| Vimentin (V9) antibody | Novocastra Laboratories | NCL-L- VIM-V9 |
||
| Tenascin C (BC-8) antibody | a gift from |
|||
| α-SMA-Cy3 (1A4) antibody | Sigma | C6198 | ||
Prolyl-4-hydroxylase |
Dako | M0877 | ||
| (5B5) antibody | ||||
| Collagen type1 1A antibody | Sigma | HPA011795 | ||
| Pan-cytokeratin antibody | Sigma | C5992 | ||
| Fibronectin antibody | BD Biosciences | 610077 | ||
S100A4/FSP-1 (fibroblast- specific protein-1) antibody |
Dako | A5114 | ||
Fibroblast surface protein (clone 1B10) antibody |
Abcam | ab11333 | ||
| MSCV-IRES-GFP construct | Request to the the authors | |||
| pBabe-puro construct | Purchase from Addgene |
|||
| Puromycin | Sigma | P8833 | ||
| DAPI | Sigma | D9564 | ||
| 15 ml conical tube | Corning | 430766 | ||
| Nude mouse | Taconic | NCRNU-F | Female NCr nude | |
| C3H/10T1/2 cells | ATCC | CCL-226 |
Referenzen
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