Анализа количественно измерить трансформирующий фактор роста (TGF)-β-индуцированной вторжения в 3-мерном гели коллагена описано. Этот тест использует преимущества серии MCF10A клеточных линий, которые представляют различные стадии развития рака молочной железы. Этот метод может быть принята для использования с другими клеточными линиями и может быть использован для исследования других возможных активаторов или ингибиторов вторжения.
TGF-β имеет противоположные роли в груди прогрессии рака, действуя как супрессоры опухолевого роста на начальном этапе, но стимулирующие инвазии и метастазирования на более поздней стадии 1,2. Более того, TGF-β, часто избыточно экспрессируется при раке молочной железы, и его экспрессия коррелирует с плохим прогнозом и метастазирования 3,4. Механизмов, посредством которых TGF-β вызывает вторжение не до конца понятны.
TGF-β вызывает ее клеточный ответ через TGF-β типа II (TβRII) и типа I (TβRI) рецепторы. По TGF-β-индуцированной heteromeric сложное образование, TβRII фосфорилирует TβRI. Активированный TβRI инициирует его внутриклеточной канонической сигнальный путь от фосфорилирования рецептора Smads (R-Smads), т.е. Smad2 и Smad3. Эти активированные R-Smads форме heteromeric комплексов с Smad4, которые накапливаются в ядре и регулируют транскрипцию генов-мишеней 5. В дополнение к ранее гвневписанной Smad пути, активация рецептора приводит к активации ряда других не Smad сигнальных путей, например Митоген активированной протеинкиназы (МАРК) пути 6.
Для изучения роли TGF-β в различных стадиях рака молочной железы, мы использовали системы клетки MCF10A. Эта система состоит из спонтанно увековечены MCF10A1 (M1) груди эпителиальных клеток 7, H-RAS преобразован М1-производных MCF10AneoT (M2), которая производит предраковых поражений у мышей, 8, и М2-производная MCF10CA1a (М4), которая была создана с М2 ксенотрансплантаты и форм высококачественного карциномы со способностью к метастазированию в легкие 9. Это MCF10A серия предлагает возможность изучать ответы клеток с различной степенью злокачественности, которые не искаженных различных генетических фоне.
Для анализа TGF-β-индуцированной вторжения, мы сгенерировали однотипных MCF10A сфероида клеточных культур embedded в 3D-матрицу коллагена в пробирке (рис. 1). Такие модели очень напоминают человеческих опухолей в естественных условиях путем создания градиента кислорода и питательных веществ, в результате активной и инвазивных клеток на улицу и покоя и даже некротических клеток внутри сфероида 10. Сфероид основаны анализы также показали, чтобы лучше резюмировать лекарственной устойчивостью, чем монослой культур 11. Это MCF10 3D модель системы позволяет исследовать воздействие TGF-β сигнализации на инвазивные свойства грудного клетки на различных стадиях злокачественных новообразований.
Мы создали сфероида модель, в которой MCF10A1 клетки и ее производных злокачественных вторгнуться в коллагеновой матрице в TGF-β-зависимым образом. Во-первых, сфероидов образуются в 96-скважин круглым дном подвеской плит в присутствии метилцеллюлозы. Конечно, также П-образные поли-НЕМА покр?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Кен Ивата (OSI Pharmaceuticals, Нью-Йорк, США) для реагентов и Фред Миллер (Barbara Ann Karmanos Рак Intitute, Детройт, США) для клеточных линий.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
pH indicator strips | Merck | 9533 | |
96-well suspension plates |
Greiner Bio-one | 650 185 | |
96-well adhesion TC plates |
Greiner Bio-one | 655 180 |