Organ Kültür bozulmamış Sığır Kuyruğu İntervertebral Disklerin Hazırlanması
Summary
Bu protokol, organ kültürü için coccygeal sığır intervertebral diskler için hasat tekniği göstermektedir.<em> In vitro</em> Organ kültürü.
Abstract
Intervertebral disk (IVD) vertebra vertebra için bağlayan omurga ortak. Bu, omurga yükleme aktarmak ve omurga esnekliği sağlamak için fonksiyonlar. Üç bölmeden oluşur: anulus fibrosus (AF) ve her iki tarafta vertebral gövde NP ve AF bağlayan iki kıkırdak omurun kapsayan içteki düzeyde ayırır Nükleus pulpozusun (NP). Muhtemelen dejeneratif intervertebral disk hastalığı (DDH) ve disk hernileri nedeniyle Diskojenik ağrısı, modern toplumda önemli bir sorun olarak tespit edilmiştir. IVD yozlaşma olası mekanizmaları incelemek için, canlı disk hücreleri ile yapılan in vitro organ kültürü sistemleri son derece çekici. Sağlam sığır coccygeal IVD'ler in vitro kültürü, iyi kontrollü fizyolojik ve mekanik ortamda mekanik-biyolojik yönlerini çalışma sağlayan ilgili bir model sistem, ilerlemiştir . Sığır kuyruğu IVD'ler yüksek sayıda nispeten kolay elde edilebilird insan lomber IVD'ler hücre yoğunluğu, hücre popülasyonu ve boyutları bakımından çok benzer. Ancak, beslenme yollarının açıkça pıhtılaşmış kan tarafından bloke edildi yana, kıkırdak omurun ve kemik omurun istinat önceki sığır kaudal IVD hasat teknikleri, kültür 1-2 gün sonra başarısız oldu. IVD'ler büyük avasküler organları, böylece NP hücrelere besin, sadece komşu vertebral gövde kılcal tomurcukları aracılığıyla difüzyon bağımlı. Son plağın yüzeylerde kemik enkaz ve pıhtılaşmış kan varlığı, disk ve uzlaşma hücre canlılığı merkezi haline besin difüzyon engel teşkil edebilir. Grubumuz için düşük kontaminasyon riski ile kuyruk IVD'ler "crack" için görece hızlı bir protokoldür kurdu. Biz taze kesilmiş, kan pıhtılaşması ve kesim artıkları kaldırır ve son derece verimli beslenme difüzyon yolu yeniden açar bir cerrahi jet lavaj sistemi kullanarak kemik uç plakası yüzeyler permeabilize mümkünIVD merkezinde. Her iki tarafta vertebral kemik büyüme plaklarının varlığı kaçınılması gereken ve kültürüne önce kaldırılmalıdır. Bu video, hazırlanması sırasında çok önemli adımlar anahat ve yüksek hücre canlılığı sürdürmek için 14 gün ücretsiz şişme kültürün etkisi altında başarılı bir organ kültürü anahtarı göstermek. Uygun mekanik çevre mekanik yüklenme biyoreaktör kullanılarak korunabilir kültürü süresi uzatılabilir. Burada gösterilen tekniği, domuz, koyun ve tavşangillere kaudal ve lomber IVD izolasyon gibi diğer hayvan türlerinin uzatılabilir.
Protocol
Discussion
Başarılı organ kültürü için ilk adım eksplant kontamine olmaması gerektiğini emin olun. Prosedüre başlamadan önce kuyruk tenli olmalıdır. Herhangi bir hayvan kılı steril bir laboratuvar haline getirdiği kirlenme açısından sorunlu olabilir. Sığır kuyruğu ideal (bu ilk hücre canlılığı etkiler) mümkün olduğunca taze olmalıdır. Ayrıca, betadin yıkama adım daha kontaminasyon riskini azaltmak için önerilmektedir. IVD vertebra gövdesi ayrı bir ölçüye göre bıçak tutucu ve bir çek…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNF # 310030-127586/1) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
Referenzen
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture. Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).
- Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion. Spine (Phila Pa 1976). , (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers. Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system. Spine. 31, 2918-2925 (2006).
- Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs. Spine. 31, 2665-2673 (2006).
- Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent. J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).
- Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology. Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).
- Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. European Spine Journal. , 1-11 (2011).
