تأكيد المسار الأيضي والاكتشاف من خلال 13 C - وضع العلامات من الأحماض الأمينية Proteinogenic
Summary
13 C – النظائر الوسم هو تقنية مفيدة لتحديد استقلاب الخلية المركزية لمختلف أنواع الكائنات الحية الدقيقة. بعد أن تم مثقف الخلايا مع ركيزة محددة المسمى ، يمكن GC – MS قياس تكشف المسارات الأيضية الوظيفية استنادا إلى أنماط وسم فريدة من نوعها في الأحماض الأمينية proteinogenic.
Abstract
الميكروبات والمسارات الأيضية المعقدة التي يمكن أن يتم التحقيق باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية وعلم الجينوم وظيفية. أسلوب واحد مهم لدراسة استقلاب الخلية المركزية واكتشاف الانزيمات الجديدة هو 13 C – 1 ساعدت تحليل الأيض. وتستند هذه التقنية على وضع العلامات النظائر ، حيث يتم تغذية الميكروبات مع ركائز المسمى C 13. من خلال تتبع مسارات الانتقال بين ذرة الأيضات في شبكة الكيمياء الحيوية ، ويمكننا تحديد مسارات وظيفية جديدة واكتشاف الانزيمات.
كوسيلة مكملة لtranscriptomics والبروتيوميات ، وأساليب isotopomer بمساعدة تحليل المسارات الأيضية تحتوي على ثلاث خطوات رئيسية 2. أولا ، نحن تنمو الخلايا مع ركائز المسمى C 13. في هذه الخطوة ، وتكوين وسيلة واختيار من ركائز المسمى هما عاملان رئيسيان. لتجنب الضوضاء القياس من الكربون غير المسمى في المكملات الغذائيةمطلوب وسيط مع الحد الأدنى من مصدر وحيد للكربون. علاوة على ذلك ، ويستند اختيار ركيزة المسمى على مدى فعالية سيكون توضيح المسار يجري تحليلها. لأن الانزيمات رواية مختلفة الفراغية غالبا ما تنطوي على رد فعل أو منتجات وسيطة ، بصفة عامة ، ركائز الكربون المسمى منفردة أكثر إفصاحا للكشف عن مسارات الرواية من تلك المسماة موحد للكشف عن مسارات الرواية 3 ، 4 ، وثانيا ، نقوم بتحليل الحمض الأميني أنماط العلامات باستخدام GC – MS. الأحماض الأمينية هي وفيرة من البروتين وبالتالي يمكن الحصول عليها من التحلل الكتلة الحيوية. يمكن أن الأحماض الأمينية التي كتبها N – derivatized (ثالثي butyldimethylsilyl) – N – methyltrifluoroacetamide (TBDMS) قبل فصل GC. يمكن أن تكون مجزأة الأحماض الأمينية TBDMS derivatized بواسطة MS والنتيجة في صفائف مختلفة من شظايا. استنادا إلى نسبة الكتلة (م / ض) تهمة من الأحماض الأمينية مجزأة وغير مجزأة ، يمكننا أن نستنتج أن أنماط المسمى ممكن من الأيضات المركزية التيالسلائف من الأحماض الأمينية ، وثالثا ، علينا تتبع التحولات الكربون 13C في المسارات المقترحة ، واستنادا إلى البيانات isotopomer ، تأكيد ما إذا كانت هذه المسارات هي 2 النشطة. قياس الأحماض الأمينية النظائر يوفر معلومات عن العلامات التجارية حوالي ثمانية الأيضات السلائف حاسما في عملية الأيض المركزية. يمكن لهذه العقد الأيضية الرئيسية تعكس مهام المسارات المركزية المرتبطة بها.
ويمكن تحليل عملية الأيض 13 C – ساعدت عبر proteinogenic الأحماض الأمينية المستخدمة على نطاق واسع لتوصيف وظيفي في استقلاب الجرثومية سيئة اتسمت 1. في هذا البروتوكول ، وسوف نستخدم Cyanothece 51142 لان السلالة نموذج للتدليل على استعمال الكربون من ركائز المسمى لاكتشاف وظائف جديدة الأنزيمية.
Protocol
Discussion
يتكون هذا البروتوكول للتغذية الخلية مع ركيزة وصفت وقياس الناتج أنماط العلامات النظائر في الأحماض الأمينية عبر GC – MS. منذ MS البيانات (م / ض النسب) تعطي فقط من المبلغ الإجمالي لوضع العلامات من الأيونات MS ، لدينا لتقييم توزيعات isotopomer من الأحماض الأمينية عن طريق فحص نسب م / …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة شهادة NSF (MCB0954016) والطاقة الحيوية وزارة الطاقة بحوث غرانت (DEFG0208ER64694).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | – |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | – |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | – |
| GC Columns | J&W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | – |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | – |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | For drying amino acid samples |
Referenzen
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
- Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
- Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
- Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
- Wittmann, C. Fluxome analysis using GC-MS. Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).
- Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
- Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
- Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
- Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
- Tang, K. -. H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
- Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
- Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
- Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
- Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. , (2011).
- Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
- Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
- Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
- Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
- Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
- Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
- Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).
