Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13 C-etiketleme
Summary
13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.
Abstract
Mikroplar, biyokimya ve işlevsel genomik yöntemleri kullanılarak araştırılmalıdır karmaşık metabolik yollar var. Hücre merkezi metabolizma incelemek ve yeni enzimler keşfetmek için önemli bir teknik, 13 C-destekli metabolizma analizi 1 . Bu teknik izotopik etiketleme, mikropların 13 C etiketli substratları ile beslenen sayede dayanmaktadır. Biyokimyasal ağ metabolitleri arasında atom geçiş yolları takip ederek, işlevsel yollar belirlemek ve yeni enzimler keşfetmek.
Transkriptomik ve proteomik, metabolik yollarının isotopomer yardımlı analizi için tamamlayıcı bir yöntem yaklaşımları üç önemli adımlar 2 içeren İlk 13 C etiketli substratlar hücreleri büyür. Bu adımda, orta ve etiketli yüzeylerin seçimi kompozisyon iki önemli faktör vardır. Besin takviyeleri etiketli karbon ölçümü gürültüleri önlemek için, Tek bir karbon kaynağı ile en az bir ortam gereklidir. Ayrıca, etiketli bir substrat seçim analiz edilen yolun açıklamak ne kadar etkili dayanmaktadır. Roman enzimler genellikle farklı reaksiyon stereokimya genel veya ara ürünler, içerdiğinden, tek başına etiketli karbon yüzeyler, roman yollar 3, 4 tespiti için düzgün etiketli olanlardan daha roman yollarının tespiti için daha bilgilendirici İkincisi, biz GC kullanarak amino asit etiketleme kalıplarını analiz -MS. Amino asitler protein bol miktarda bulunmaktadır ve dolayısıyla, biyokütle hidroliz elde edilebilir. Amino asitler, GC ayırma önce N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) derivatized olabilir. TBDMS derivatized amino asitler, MS ve parçaları farklı diziler sonucu parçalanmış olabilir. Parçalanmış ve parçalanmamış amino asitler (m / z) oranı sorumlu kitle dayanarak, merkezi metabolitlerin mümkün etiketli desen anlayamayacağımızamino asitlerin öncüleri Üçüncü olarak, biz bu yolları 2 aktif olup olmadığını onaylamak, isotopomer verilere göre, önerilen yollar 13C karbon geçişleri izlemek ve. Amino asit ölçümü izotopik etiketleme merkezi metabolizma sekiz önemli habercisi metabolitleri hakkında bilgi sağlar. Bu metabolik anahtar düğümler ilişkili merkezi yollarının fonksiyonlarını yansıtır.
Aminoasittir ile 13 C-destekli metabolizma analizi kötü karakterize mikrobiyal metabolizma 1 fonksiyonel karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılır . Bu protokol, yeni enzimatik fonksiyonları keşfetmek için etiketli karbon substratların kullanımını göstermek için model suşu olarak Cyanothece 51.142 kullanacaktır.
Protocol
Discussion
Bu protokol etiketli substrat hücre GC-MS ile amino asitler beslenme ve elde edilen izotopik etiketleme desen ölçme oluşmaktadır. MS veri (m / z oranlarına) MS iyonlarının etiketleme sadece toplam miktar vermek zamandan beri, biz inceleyerek hem de parçalanmamış (E-57) + m / z oranları ve parçalanmış amino asitler, amino asitlerin isotopomer dağılımları değerlendirmek için (yani, (M-159) + (F302) +). Ayrıca, kimyasal olarak benzer bir ortamı ancak farklı etiketlem…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, bir NSF Kariyer Grant (MCB0954016) ve DOE Biyoenerji Araştırma Bursu (DEFG0208ER64694) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | – |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | – |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | – |
| GC Columns | J&W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | – |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | – |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | For drying amino acid samples |
Referenzen
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
- Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
- Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
- Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
- Wittmann, C. Fluxome analysis using GC-MS. Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).
- Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
- Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
- Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
- Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
- Tang, K. -. H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
- Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
- Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
- Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
- Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. , (2011).
- Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
- Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
- Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
- Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
- Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
- Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
- Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).
