Colonization von Euprymna scolopes Squid durch Vibrio fischeri</em
Summary
Die Methode beschreibt das Verfahren, mit dem die Hawaiian Bobtail Squid,<em> Euprymna scolopes</em> Und ihre bakteriellen Symbionten,<em> Vibrio fischeri</em>, Werden getrennt und dann eingeführt werden, um für spezifische Besiedlung des Tintenfisches Lichtorgel von den Bakterien ermöglichen angehoben. Colonization Erkennung von Bakterien stammende Lumineszenz und durch direkte Auszählen von Kolonien werden beschrieben.
Abstract
Spezielle Bakterien werden in Zusammenarbeit mit tierischem Gewebe 1-5 gefunden. Solche Wirt-Bakterien-Assoziationen (Symbiosen) kann schädlich sein (pathogene), haben kein Fitness-Folge (Kommensalen), oder von Vorteil sein (mutualistic). Während viel Wert wurde auf pathogene Interaktionen gegeben wurde, ist wenig über die Prozesse, die die reproduzierbare Erfassung von nützlichen / symbiotischer Bakterien aus der Umwelt zu diktieren bekannt. Die Lichtorgan Mutualismus zwischen der marinen Gram-negative Bakterium V. fischeri und die hawaiianische Bobtail Tintenfisch, E. scolopes, stellt eine sehr spezifische Interaktion, in denen ein Wirt (E. scolopes) stellt eine symbiotische Beziehung mit nur einer Bakterienart (V. fischeri) im Laufe seiner Lebensdauer 6,7. Biolumineszenz von V. produziert fischeri in dieser Interaktion ist daher ein Anti-Verdrängung Vorteil E. scolopes bei nächtlichen Aktivitäten 8,9, währenddas nährstoffreiche Wirtsgewebe stellt V. fischeri mit einer geschützten Nische 10. Während jeder Host-Generation wird diese Beziehung rekapituliert und damit zu einer vorhersehbaren Prozess, der im Detail in verschiedenen Stadien der Entwicklung symbiotische beurteilt werden kann. Im Labor der Jugendliche Tintenfisch Luke aposymbiotically (unbesiedelten), und, wenn innerhalb der ersten 30-60 Minuten gesammelt und an Symbionten-freies Wasser, kann nur durch die experimentelle Inokulum 6 besiedelt werden. Diese Wechselwirkung bietet daher ein nützliches Modell, bei dem die einzelnen Schritte, die für bestimmte Erwerb einer symbiotischen Mikroben aus der Umgebung 11,12 führen zu bewerten.
Hier beschreiben wir eine Methode, um den Grad der Kolonisierung, die beim neu geschlüpften aposymbiotic E. tritt bewerten scolopes werden (künstliche) mit Meerwasser ausgesetzt V. fischeri. Dieser einfache Test beschreibt Inokulation natürlichen Infektion und Erholungder bakteriellen Symbionten aus dem im Entstehen begriffenen Lichtorgel von E. scolopes. Es wird darauf geachtet, um eine konsistente Umgebung für die Tiere während symbiotische Entwicklung zu sorgen, insbesondere im Hinblick auf die Wasserqualität und Licht Cues. Methoden, um die symbiotische Bevölkerung beschrieben charakterisieren, gehören (1) Messung von Bakterien stammende Biolumineszenz, und (2) direkte Zählung der Kolonie erholte Symbionten.
Protocol
Discussion
Die Kolonisierung beschriebene Assay ermöglicht die Analyse einer natürlichen symbiotischen Prozess, in einer kontrollierten Laborumgebung. Als solche kann sie verwendet werden, um die Besiedlung durch Mutantenstämmen, die von verschiedenen natürlichen Isolaten und unter unterschiedlichen chemischen Regime zu beurteilen. Variationen der beschriebenen Experimente werden üblicherweise verwendet, um verschiedene Aspekte der Symbiose zu bewerten. Die Kinetik der Kolonisierung ist anhand von Lichtemission während der e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich Mattias Gyllborg für Kalmare von Einrichtungen zur Förderung und für Kommentare zu diesem Manuskript, Michael Hadfield und die Kewalo Marine Laboratory für die Unterstützung während der Bereich Sammlung, und Mitgliedern der Ruby und McFall-Ngai Labor für Beiträge zu diesem Protokoll. Arbeit in der Mandel-Labor ist von der NSF IOS-0843633 gefördert.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
Referenzen
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