Colonização de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri</em
Summary
O método descreve o procedimento pelo qual o squid bobtail havaiana,<em> Euprymna scolopes</em> E seu simbionte bacteriano,<em> Vibrio fischeri</em>, São levantadas separadamente e, em seguida, introduzido para permitir a colonização específica do órgão luz lula pelas bactérias. Detecção de colonização por bactérias luminescência e derivados por meio de contagem direta colônia são descritas.
Abstract
Bactérias específicas são encontrados em associação com tecidos animais 1-5. Tais host-bacterianas associações (simbiose) pode ser prejudicial (patogênicos), não tem conseqüência fitness (comensal), ou ser benéfica (mutualismo). Enquanto muita atenção tem sido dada às interações patogênicas, pouco se sabe sobre os processos que determinam a aquisição reprodutível de benéficos / comensal bactérias do ambiente. O mutualismo luz de órgãos entre a bactéria Gram-negativa marinha V. fischeri eo havaiano bobtail lula, E. scolopes, representa uma interação altamente específica em que um host (E. scolopes) estabelece uma relação simbiótica com apenas uma espécie bacteriana (V. fischeri) durante todo o curso da sua vida 6,7. A bioluminescência produzido por V. fischeri durante essa interação fornece um benefício anti-predatória de E. scolopes durante atividades noturnas 8,9, enquantoo tecido hospedeiro rico em nutrientes fornece V. fischeri com um nicho protegido 10. Durante cada geração de acolhimento, esta relação é recapitulada, representando assim um processo previsível que pode ser avaliado em detalhe em vários estágios de desenvolvimento simbiótico. No laboratório, a juvenil lula escotilha aposymbiotically (não colonizada), e, se recolhida dentro dos primeiros 30-60 minutos e transferida para simbionte livre de água, não podem ser colonizados excepto por o inoculo experimental 6. Esta interacção proporciona assim um sistema modelo útil no qual se pode avaliar os passos individuais que levam à aquisição específica de um micróbio simbiótica a partir do ambiente 11,12.
Aqui nós descrevemos um método para avaliar o grau de colonização que ocorre quando recém-eclodidos E. aposymbiotic scolopes são expostos a (artificial) a água do mar que contêm V. fischeri. Este ensaio simples descreve a inoculação, a infecção natural, e recuperaçãodo simbionte bacteriano do órgão luz nascente da E. scolopes Care. é levado para proporcionar um ambiente consistente para os animais durante o desenvolvimento simbiótico, especialmente no que diz respeito à qualidade da água e sinais de luz. Métodos para caracterizar a população simbiótico descrito incluem (1) medição da bioluminescência bactérias derivados, e (2) colônia contagem direta de simbiontes recuperados.
Protocol
Discussion
O ensaio de colonização descrito permite a análise de um processo natural simbiótica num ambiente controlado de laboratório. Como tal, pode ser usado para avaliar a colonização por estirpes mutantes, por diferentes isolados naturais, e sob regimes químicas diferentes. Variações sobre os experimentos descritos são comumente usados para avaliar diferentes aspectos da simbiose. A cinética da colonização pode ser medido por análise de luminescência durante as primeiras 24 h, o que pode ser detectado au…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Mattias Gyllborg para squid apoio instalações e dos comentários deste manuscrito, Michael Hadfield eo Kewalo Laboratório Marinho de assistência durante a coleta de campo, e os membros do Laboratório de Ruby e McFall-Ngai para contribuições para este protocolo. Trabalho no Laboratório de Mandel é suportado pela NSF IOS-0843633.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
Referenzen
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