Un dispositif simple microfluidique a été développé pour effectuer anesthésie gratuit<em> In vivo</em> Imagerie de<em> C. elegans</em>, Intact<em> Drosophila</em> Larves et des larves de poisson zèbre. Le dispositif utilise une membrane déformable PDMS pour immobiliser ces organismes modèles pour effectuer une imagerie laps de temps de nombreux procédés tels que battement de coeur, la division cellulaire et subcellulaire de transport neuronale. Nous démontrons l'utilisation de cet appareil et de montrer des exemples de différents types de données collectées à partir des systèmes de modèles différents.
Micro fabriqués dispositifs fluidiques fournir un accès micro-environnement pour les études in vivo sur de petits organismes. Procédés de fabrication simples sont disponibles pour dispositifs microfluidiques utilisant des techniques de lithographie douce 1-3. Dispositifs microfluidiques ont été utilisés pour les sous-imagerie cellulaire 4,5, in vivo microchirurgie au laser et imagerie cellulaires 2,6 4,7. L'imagerie in vivo nécessite l'immobilisation des organismes. Ceci a été réalisé en utilisant une aspiration 5,8, 6,7,9 canaux coniques, des membranes déformables, 2-4,10 aspiration avec refroidissement supplémentaire 5, gaz anesthésique 11, gels sensibles à la température 12, 13 et colle cyanoacrylate anesthésiques tels que le lévamisole 14 , 15. Anesthésiques couramment utilisés influencer la transmission synaptique 16,17 et sont connus pour avoir des effets néfastes sur la sous-cellulaire 4 transport neuronal. Dans cette èreudy nous démontrons une membrane à base de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) dispositif qui permet l'immobilisation sans anesthésie intactes organismes modèles génétiques telles que Caenorhabditis elegans (C. elegans), larves de drosophile et les larves de poisson zèbre. Ces organismes modèles sont adaptés pour des études in vivo dans des dispositifs microfluidiques en raison de leurs faibles diamètres et des organismes optiquement transparents ou translucides. Diamètres de corps vont de ~ 10 um à 800 um ~ pour les premiers stades larvaires de C. larves elegans et le poisson zèbre et nécessitent des dispositifs microfluidiques de tailles différentes pour atteindre une immobilisation complète pour la résolution imagerie time-lapse élevé. Ces organismes sont immobilisés en utilisant la pression appliquée par l'azote gazeux comprimé à travers une colonne de liquide et imagée à l'aide d'un microscope inversé. Animaux libérés du piège de revenir à la locomotion normale dans les 10 min.
Nous démontrons quatre applications imagerie time-lapse en C. elegansnommément imagerie mitochondriale de transport dans les neurones, le transport vésiculaire présynaptique dans un transport défectueux mutant, le transport des récepteurs du glutamate et de la division cellulaire Q neuroblastes. Les données obtenues à partir de ces films montrent que l'immobilisation microfluidique est un moyen utile et précise de l'acquisition de données in vivo d'événements cellulaires et sub-cellulaires par rapport aux animaux anesthésiés (figure 1J et 3C-F 4).
Dimensions de l'appareil ont été modifiées pour permettre imagerie time-lapse de différents stades de C. elegans, Drosophila larves de premier stade et les larves de poisson zèbre. Transport de vésicules marquées par synaptotagmine marqués à la GFP (syt.eGFP) dans les neurones sensoriels montre mouvement dirigé des marqueurs de vésicules synaptiques cholinergiques exprimés dans les neurones sensoriels de larves de premier stade intacte chez la drosophile. Un dispositif similaire a été utilisée pour effectuer imagerie time-lapse de battement de coeur dans ~ 30 heures après la fécondation (HPF)poisson-zèbre larves. Ces données montrent que les dispositifs simples que nous avons développées peuvent être appliquées à une variété de systèmes modèles pour étudier les phénomènes cellulaires plusieurs biologiques et de développement in vivo.
Dispositifs microfluidiques en PDMS sont optiquement transparents peuvent donc être utilisés pour une grande résolution imagerie in vivo de tout organisme modèle transparent / translucide. Notre modèle est approprié pour un grossissement spatio-temporelle d'imagerie élevé d'événements cellulaires et sous-cellulaires intactes dans les animaux vivants. En utilisant des techniques de microfabrication de lithographie douce permet une manipulation aisée des dimensions de l'appareil pour les di…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Dr Ray Krishanu pour les stocks de drosophile, Tarjani Agarwal pour maintenir un Drosophila cage, Peter Juo pour nuIs25 et CGC pour C. souches elegans. SPK fait jsIs609 dans le laboratoire de Michael Nonet l'. Nous remercions Arpan Agnihotri (BITS Pilani) pour son aide dans imagerie time-lapse de transport mitochondries des animaux jsIs609 dans des dispositifs microfluidiques. Nous sommes reconnaissants au Dr Vatsala Thirumalai et Surya Prakash pour nous fournir des embryons de poisson zèbre. Nous remercions le Dr Krishna et CIFF au SPNE pour l'utilisation du microscope confocal à disque rotatif soutenu par le Ministère de la Science et de la Technologie, Centre de nanotechnologie (n ° SR/55/NM-36-2005). Nous remercions également Kaustubh Rau, V. Venkatraman et Chetana Sachidanand pour les discussions. Ce travail a été financé par la DBT bourse post-doctorale (SM), l'heure d'été accélérée régime (SM) et une subvention de la TCD (SPK). SA a été soutenue par des subventions DST et le CSIR à SPK.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
Developer | Microchem | SU8 Developer | |
Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |