Um dispositivo simples de microfluidos foi desenvolvido para realizar anestésico livre<em> In vivo</em> Imagiologia de<em> C. elegans</em>, Intacta<em> Drosophila</em> Larvas e larvas de peixe-zebra. O dispositivo utiliza uma membrana deformável PDMS para imobilizar estes organismos modelo, a fim de realizar imagem de lapso de tempo de vários processos, tais como o batimento cardíaco, a divisão celular e subcelular transporte neuronal. Nós demonstramos a utilização deste dispositivo e mostram exemplos de diferentes tipos de dados recolhidos a partir de sistemas de modelos diferentes.
Micro fabricados dispositivos fluídicos fornecer um micro-ambiente acessíveis para estudos in vivo sobre os organismos pequenos. Processos de fabricação simples estão disponíveis para dispositivos microfluídicos usando técnicas de litografia suave 1-3. Dispositivos microfluídicos têm sido utilizados para sub-celular de imagem 4,5, in vivo microcirurgia laser 2,6 e imagiologia celular 4,7. In vivo de imagem requer a imobilização dos organismos. Isto foi conseguido usando sucção 5,8, 6,7,9 canais cónicos, membranas deformáveis 2-4,10, com arrefecimento adicional de sucção 5, o gás anestésico 11, geles sensíveis à temperatura 12, 13 e cola de cianoacrilato, tais como anestésicos levamisole 14 de 15. Anestésicos comumente utilizados influenciar a transmissão sináptica 16,17 e são conhecidos por terem efeitos prejudiciais sobre a sub-celular de transporte 4 neuronal. Neste stUdy demonstramos uma membrana de base de poli-dimetil-siloxano dispositivo (PDMS) que permite a imobilização sem anestésico intactos organismos modelo genéticas tais como Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila e larvas de larvas de peixe zebra. Estes organismos modelo são adequados para estudos in vivo em dispositivos microfluídicos devido às suas diâmetros pequenos e corpos opticamente transparentes ou translúcidas. Diâmetros de corpo variar de 10 a ~ uM ~ 800 uM para os primeiros estádios larvais de C. elegans e larvas do peixe-zebra e exigir dispositivos microfluídicos de tamanhos diferentes para atingir a imobilização completa de alta resolução de imagem time-lapse. Estes organismos são imobilizadas através de pressão aplicada por comprimido de gás de azoto através de uma coluna de líquido e visualizados utilizando um microscópio invertido. Animais libertados da armadilha retornar para locomoção normais dentro de 10 min.
Demonstramos quatro aplicações de lapso de tempo de imagem em C. elegansou seja, a imagem de transporte mitocondrial nos neurônios, pré-sináptica transporte vesicular em um transporte defeituoso mutante transporte receptor, glutamato e divisão celular Q neuroblastos. Os dados obtidos a partir de tais filmes mostram que a imobilização de microfluidos é um meio útil e precisa de adquirir dados in vivo de eventos celulares e subcelulares em comparação com animais anestesiados (Figura 1J e 3C F-4).
Dimensões do dispositivo foram alteradas para permitir lapso de tempo imagens de diferentes fases da C. elegans, primeiro larvas Drosophila e larvas de peixe-zebra. Transporte de vesículas marcadas com sinaptotagmina marcados com GFP (syt.eGFP) em neurônios sensoriais mostra movimento dirigido de marcadores das vesículas sinápticas expressos em colinérgicos neurônios sensoriais intactas em primeira larvas Drosophila estádio. Um dispositivo semelhante tem sido utilizada para a realização de lapso de tempo de imagem de pulsação em ~ 30 h pós-fertilização (hpf)Zebrafish larvas. Estes dados mostram que os dispositivos simples que desenvolvemos pode ser aplicada a uma variedade de sistemas modelo para estudar os fenómenos biológicos diversos celulares e de desenvolvimento in vivo.
Dispositivos PDMS microfluidicos são opticamente transparentes, por conseguinte, pode ser utilizado em alta resolução em imagiologia in vivo de qualquer organismo modelo transparente / translúcida. Nosso projeto é adequado para alta de ampliação de imagem espaço-temporal de eventos celulares e sub-celular em intactas animais vivos. Microfabricação utilizando técnicas de litografia suave permite uma fácil manipulação de dimensões do dispositivo para vários tamanhos de organismos modelo. …
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Krishanu Ray para ações de Drosophila, Tarjani Agarwal para a manutenção de uma gaiola Drosophila, Peter Juo para nuIs25 e CGC para C. estirpes elegans. SPK jsIs609 feito em laboratório de Michael Nonet. Agradecemos Arpan Agnihotri (BITS Pilani) por sua ajuda na lapso de tempo de imagem do transporte de mitocôndrias jsIs609 animais em dispositivos microfluídicos. Somos gratos ao Dr. Vatsala Thirumalai e Prakash Surya para fornecer-nos com embriões de zebrafish. Agradecemos ao Dr. Krishna e CIFF em BCN para uso do microscópio confocal disco giratório apoiado pelo Departamento de Ciência e Tecnologia Centro-de Nanotecnologia (No. SR/55/NM-36-2005). Agradecemos também Kaustubh Rau, V. Venkatraman e Chetana Sachidanand para as discussões. Este trabalho foi financiado pela bolsa de pós-doutorado DBT (SM), o esquema de DST fast-track (SM) e uma subvenção de DBT (SPK). SA foi apoiado pelo horário de verão e CSIR subsídios a SPK.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
Developer | Microchem | SU8 Developer | |
Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |