Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello
Summary
Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.
Abstract
Comprendere le proprietà biofisiche e l'organizzazione funzionale dei neuroni singoli e come informazioni di processo è fondamentale per capire come funziona il cervello. La funzione primaria di qualsiasi cellula nervosa è di elaborare i segnali elettrici, solitamente da più fonti. Proprietà elettriche dei processi neuronali sono straordinariamente complessa, dinamica, e, nel caso generale, impossibile prevedere in assenza di misurazioni dettagliate. Per ottenere tale misurazione si sarebbe, idealmente, come essere in grado di monitorare, in più siti, eventi sottosoglia mentre viaggiano dai siti di origine sui processi neuronali e sommare in posizioni particolari di influenzare iniziazione potenziale d'azione. Questo obiettivo non è stato raggiunto in un neurone a causa di limitazioni tecniche di misurazioni che utilizzano elettrodi. Per superare questo inconveniente, è altamente desiderabile per integrare la patch-elettrodo approccio con tecniche di imaging che permettono ampia Recordin parallelogs da tutte le parti di un neurone. Qui, descriviamo una tecnica – ottico di registrazione dei transitori potenziale di membrana con organici tensione coloranti sensibili (V m-imaging) – caratterizzati da sub-millisecondo e sub-micrometrica risoluzione. Il nostro metodo si basa sul lavoro pionieristico di sonde molecolari tensione-sensibili 2. Molti aspetti della tecnologia iniziale sono stati continuamente migliorati per decenni 3, 5, 11. Inoltre, lavoro precedente documentato due caratteristiche essenziali di V m-imaging. In primo luogo, i segnali di fluorescenza sono linearmente proporzionale al potenziale di membrana su tutta la gamma fisiologica (-100 mV a +100 mV, 10, 14, 16). In secondo luogo, i neuroni di carico con la tensione di colorante sensibile usato qui (JPW 3028) non ha effetti farmacologici rilevabili. L'ampliamento del picco registrato durante il caricamento del colorante è completamente reversibile 4, 7. Inoltre, prove sperimentali mostrano che è possibile ottenereun numero significativo (fino a centinaia) di registrazioni prima di eventuali effetti rilevabili fototossiche 4, 6, 12, 13. Attualmente, sfruttare la luminosità eccezionale e stabilità di una sorgente di luce laser a lunghezza d'onda quasi ottimale per massimizzare la sensibilità della m-imaging tecnica V. La sensibilità attuale consente registrazioni di più siti di ottica di V transitori m da tutte le parti di un neurone, tra assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e spine dendritiche individuali. Le informazioni acquisite sulle interazioni di segnale possono essere analizzati quantitativamente e direttamente visualizzati sotto forma di un film.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un voltaggio-dipendenti metodo di registrazione colorante per monitorare l'attività elettrica dei neuroni individuali con sub-micrometrica e sub-millisecondo risoluzione spazio-temporale. Eccitazione laser a lunghezza d'onda quasi ottimale (considerando le dimensioni segnale) migliorato la sensibilità di registrazione di un fattore ~ 50 rispetto agli approcci precedenti. La sensibilità attuale consente il monitoraggio dei segnali elettrici da tutte le parti di neuroni individual…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati ai nostri collaboratori Knut Holthoff, Arthur Konnerth e Marco Canepari che hanno partecipato allo sviluppo iniziale di questa tecnica e per Leslie M. Loew per la gentile fornitura di coloranti. Supportato da NSF concedere IOS-0817969, sovvenzioni NIH NS068407 e M136043 e Kavli Istituto di Neuroscienze all'Università di Yale.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
Referenzen
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