In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo

Summary

Espressione ectopica è una tecnica per chiarire il ruolo microRNA nello sviluppo del cervello. Tuttavia, il targeting aree specifiche utilizzando in elettroporazione ovo è impegnativo. Qui vi mostriamo un modo efficiente alle regioni mesencefalo ventrale e dorsale in modo selettivo l'elettroporazione.

Abstract

RNA non codificanti sono altri giocatori nella regolazione dell'espressione genica. Mirata in elettroporazione ovo di settori specifici fornisce uno strumento unico per il controllo spaziale e temporale di espressione microRNA ectopica. Tuttavia, le strutture cerebrali ventrali come mesencefalo ventrale sono piuttosto difficili da raggiungere per eventuali manipolazioni. Qui, dimostriamo un modo efficiente per l'elettroporazione di miRNA nel mesencefalo ventrale con elettrodi di platino sottili. Questo metodo offre un modo affidabile per trasfettare aree specifiche del mesencefalo e uno strumento utile per studi in vivo.

Introduction

Il riconoscimento di piccoli RNA non codificanti come lettori aggiuntivi per l'espressione genica ha lanciato una nuova complessità genomica regolamento programmazione / gene. Diverse specie di RNA non codificanti hanno importanza funzionale in cellule neurali, comprese le piccole non codificanti RNA ^1-4. I microRNA (miR o miRNA), per esempio, mostrano profili di espressione distinti e mutevoli nel cervello in via di sviluppo ^5. Mirata in elettroporazione ovo di embrioni di pollo offre un'opportunità unica per il controllo spaziale e temporale di espressione genica e silenziamento durante lo sviluppo.

Questo video mostra le varie fasi di esecuzione di espressione ectopica di miR in specifiche aree del mesencefalo pulcino utilizzo in ovo elettroporazione ^6-10. Per garantire un effetto di lunga durata di questi piccoli RNA non codificanti nelle cellule, la sequenza di DNA di miR sono stati clonati in vettori mono o bi-cistronic. Perché in elettroporazione ovo, miR contenente vettore viene iniettato nel tubo neurale mesencefalo esponendo l'embrione dopo aver effettuato una piccola finestra nel guscio dell'uovo. Trasfezione aree specifiche del mesencefalo più piccola (anodo) e negativo (catodo) elettrodi di platino sono collocati in posizioni specifiche. Per ventrale trasfezione mesencefalo, l'anodo si trova sotto il mesencefalo ventrale sinistro e il catodo sopra la metà destra del mesencefalo prima di applicare una corrente. L'apertura nel guscio è chiusa con nastro e embrioni vengono incubati per tutto il tempo richiesto per ogni analisi. Questo metodo è stato originariamente descritto da Muramatsu et al. ⁶ e migliorata Momose et al. ⁸ per zona specifica trasfezione.

Panoramica schematica.

1. L'embrione nell'uovo è esposto tagliando una piccola finestra in the guscio d'uovo.
2. Il vettore (s) disciolto viene iniettato nel mesencefalo usando un micro capillare.
3. Due elettrodi – disposti parallelamente o sotto e sopra l'embrione – generano un campo elettrico pulsato.
4. Il campo elettrico crea temporalmente pori nella membrana cellulare, che facilitano l'ingresso nella cellula dal DNA caricato negativamente (o RNA) attratti verso l'anodo ^11,12.

Protocol

1. Requisiti per In ovo Elettroporazione Preparazione del costrutto vettore: miR senso e antisenso primer sono stati progettati dopo le istruzioni del Ambion, ricotte e legato in ApaI / EcoRI digerito pSilencer U6.1 vettoriale. Dopo trasformazione di successo uno dei cloni risultanti stata coltivata e pSilencer plasmide è stato isolato mediante metodo di lisi alcalina utilizzando un kit di preparazione midi Quiagen. Elettrodi: Gli elettrodi possono essere …

Representative Results

L'estensione dell'area mesencefalo trasfettate con miR è visibile attraverso l'espressione di GFP da un vettore giornalista iniettato insieme al miR esprimendo vettore (Figura 2). Utilizzando elettrodi di platino con un diametro di 0,5 mm e collocato parallelamente all'asse AP di porta mesencefalo normalmente alla trasfezione di una vasta area lungo la-DV e AP-asse, compresi hindbrain, mesencefalo e talvolta diencefalo (Figure 2A e B). Le dimensioni degli elettrodi risu…

Discussion

Questo video mostra un metodo efficace per trasfettare plasmide nelle cellule neuroepiteliale di aree specifiche del mesencefalo pulcino. Impulsi elettrici rettangolari di bassa tensione possono introdurre DNA in cellule del tubo neurale pulcino in ovo ^6,16. Tuttavia, la precisione di targeting DNA è spesso ostacolata dal campo elettrico ampia, che sale attraverso le relativamente grandi elettrodi (Φ = 0,5 mm). Abbiamo cercato di affrontare questo problema utilizzando elettrodi più piccoli di diam…

Materials

Name	Company		Model
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope – fluorescence	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscope	Zeiss		Model: Stemi
Camera and software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8