복부 병아리 중뇌에있는 마이크로 RNA의 오보, 식

Summary

이소성 표현은 두뇌 발달의 마이크로 RNA의 역할을 명료하게 한 기술이다. 그러나, 비켜 일렉트로에 사용하여 특정 영역을 대상으로하는 것은 도전이다. 여기, 우리는 효율적으로 선택적으로 electroporate 복부와 등쪽 중뇌 영역에 표시됩니다.

Abstract

비 코딩 RNA를 유전자 발현을 조절하는데 추가 플레이어. 특정 지역의 OVO 일렉트로의 대상은 자궁외 마이크로 RNA 발현의 공간 및 시간 제어를위한 독특한 도구를 제공합니다. 그러나, 복부 중뇌와 같은 복부 뇌 구조는 모든 조작에 도달 오히려 어렵습니다. 여기, 우리는 얇은 백금 전극을 사용하여 복부 중뇌에 miRNA의를 electroporate하는 효율적인 방법을 보여줍니다. 이 방법은 중뇌 및 생체 연구를위한 유용한 도구의 특정 영역을 감염 될 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다.

Introduction

유전자 발현에 대한 추가 플레이어와 같은 작은 비 코딩 RNA를 인식 게놈 프로그래밍 / 유전자 조절에 새로운 복잡성을 시작했다. 비 코딩 RNA를 다른 종은 작은 비 코딩 RNA를 ^1-4 포함하는 신경 세포의 기능적인 중요성이있다. 예를 들어, 마이크로 RNA (miRNA의 미르 나)는 두뇌 개발 ⁵ 별개의 변화 발현 프로파일을 보여줍니다. 개발하는 동안 유전자 발현과 침묵의 시간 및 공간 제어를위한 유일한 기회는 병아리 태아의 비켜 일렉트로에 제공 대상.

이 동영상은 일렉트로 ^6-10 OVO에서 사용하는 병아리 중뇌의 특정 영역에 미르의 이소성 표현을 수행하는 여러 단계를 보여줍니다. 세포에있는이 작은 비 코딩 RNA를의 긴 지속 효과를 보장하기 위해, 미르의 DNA 시퀀스는 모노 – 또는 바이 cistronic 벡터에 클로닝 하였다. 비켜 일렉트로의 경우, 미르는 V를 포함엑터는 달걀 껍질에 작은 창을 한 후 배아를 노출하여 중뇌의 신경 튜브에 주입된다. 중뇌 작은 플러스 (양극)과 음극 (캐소드)의 특정 영역을 형질 백금 전극을 특정 위치에 배치됩니다. 복측 중뇌 형질 들어, 애​​노드는 좌 복부 중뇌 및 전류를인가하기 전에 중뇌의 우측 절반 상기 캐소드 밑에 배치된다. 달걀 껍질에 구멍을 테이프로 닫히고 배아는 한 어떤 분석을 위해 필요에 따라 배양된다. 이 방법은 원래 무라 마츠 등. ^(6)에 의해 설명 된 특정 지역의 형질 전환을위한 모모 세 등. ^8로 향상되었다.

도식 개요.

1. 계란의 배아는 일에 작은 창을 절단하여 노출전자 껍질.
2. 용해 벡터 (들)는 마이크로 모세관을 사용하여 중뇌 주입된다.
3. 두 개의 전극 – 병렬 또는 배아에서와 위에 배치는 – 펄스 전기장을 생성합니다.
4. 전기장은 일시적으로 양극 ^{(11, 12)에} 매력을 부정 청구 DNA (또는 RNA)에 의해 세포에 진입을 용이하게 세포막에 구멍을 만듭니다.

Protocol

1. 에서 비켜 Electroporation에 대한 요구 사항 벡터 구조를 준비 : 미르의 센스와 안티센스 프라이머, Ambion의 지시 후 설계 소둔 및 ApaI로 결찰 / 효소 EcoRI는이 실험에서 pSilencer ™의 U6.1 벡터를 소화. 성공적으로 변환 후 생성 된 클론 중 하나가 성장하고,이 실험에서 pSilencer ™ 플라스미드 Quiagen 미디 준비 키트를 사용하여 알칼리 용해 방법으로 분리 하였다. …

Representative Results

미르로 형질 중뇌 영역의 범위는 미르 발현 벡터 (그림 2)와 함께 주입 기자 벡터에서 GFP의 표현을 통해 볼 수 있습니다. 0.5 mm의 직경을 갖는 백금 전극을 사용하고 중뇌 후뇌, 때때로 간뇌 (도 2A와 B)를 포함하여 DV-및 AP-축을 따라 넓은 영역의 형질 전환에 일반적 중뇌 리드 AP 축에 평행하게 배치. 넓은 전계의 전극 결과의 크기는 뇌 영역 따라서 형질 넓은 영역에 적용. </p…

Discussion

이 비디오는 병아리 중뇌의 특정 영역의 neuroepithelial 세포에 플라스미드를 형질 할 수있는 효과적인 방법을 보여줍니다. 낮은 전압의 직사각형 전기 펄스는 ^6,16을 OVO에 병아리 신경 튜브의 세포에 DNA를 도입 할 수 있습니다. 그러나, DNA의 타겟팅 정확성은 종종 비교적 큰 전극 (Φ = 0.5 mm)을 통해 상승 넓은 전기장에 의해 방해된다. 우리는 모모 세 등. ^8의 지침에 따라 ?…

Materials

Name	Company		Model
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope – fluorescence	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscope	Zeiss		Model: Stemi
Camera and software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8