Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
Hart-en vaatziekten nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd 1. Cardiale tissue engineering houdt veel belofte om baanbrekende medische ontdekkingen te leveren aan de doelstellingen van het ontwikkelen van functionele weefsels voor cardiale regeneratie evenals in vitro screeningstesten. Toch heeft de mogelijkheid om high-fidelity modellen van hartweefsel te creëren moeilijk gebleken. Het hart van extracellulaire matrix (ECM) is een complexe structuur die bestaat uit zowel biochemische en biomechanische signalen variërend van de micro-tot op de nanometer schaal 2. Lokale mechanische belasting voorwaarden en cel-ECM interacties zijn onlangs erkend als vitale onderdelen van de cardiale tissue engineering 3-5.
Een groot deel van het cardiale ECM bestaat uitgelijnde collageenvezels met nano-schaal diameter die aanzienlijk beïnvloedt weefselarchitectuur en elektromechanische koppeling 2. Helaas, weinig methoden have in staat geweest om de organisatie van ECM vezels na te bootsen naar beneden tot op de nanometer schaal. Recente ontwikkelingen in nanofabricage technieken, echter, hebben het ontwerp en de fabricage van schaalbare steigers die de in vivo structurele en substraat stijfheid signalen van de ECM in het hart 6-9 nabootsen ingeschakeld.
Hier presenteren we de ontwikkeling van twee reproduceerbare, kosteneffectieve en schaalbare nanopatronen werkwijzen voor de functionele aanpassing van hartcellen met het biocompatibele polymeer poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) 8 en een polyurethaan (PU) gebaseerd polymeer. Deze anisotroop nanofabricated substraat (ANF) bootsen de onderliggende ECM goed-georganiseerde, uitgelijnd weefsels en kan worden gebruikt om de rol van nanotopography op celmorfologie en functie 10-14 onderzoeken.
Met behulp van een nanopatterned (NP) silicium meester als een sjabloon, wordt een polyurethaan acrylaat (PUA) mal gefabriceerd. Deze PUA mal wordt vervolgens gebruikt om pattern de PU of PLGA hydrogel via UV-ondersteunde of-oplosmiddel gemedieerde capillaire kracht lithografie (CFL), respectievelijk 15,16. In het kort, PU of PLGA pre-polymeer druppel aangebracht op een glazen dekglaasje en de PUA mal is bovenaan geplaatst. Voor UV-geassisteerde CFL, wordt de PU vervolgens blootgesteld aan UV-straling (λ = 250-400 nm) voor de genezing. Voor oplosmiddel gemedieerde CFL, wordt de PLGA reliëf met warmte (120 ° C) en druk (100 kPa). Na uitharding wordt de PUA mal afgepeld, met achterlating van een ANF's voor celkweek. Primaire cellen, zoals neonatale rat ventriculaire myocyten, alsook menselijke pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten, kan worden gehandhaafd op de ANF 2.
Introduction
Hart-en vaatziekten is de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de wereld en vormen een zware socio-economische last op een reeds gespannen globale gezondheidssysteem 1,17. Cardiale tissue engineering heeft twee verschillende doelen: (1) om beschadigde hartspier te regenereren na ischemische ziekte of cardiomyopathie of (2) een high fidelity model van het hart voor in vitro screening van geneesmiddelen of ziekte modellering creëren.
Het hart is een complex orgaan die voortdurend moeten werken om bloed naar het lichaam. Dicht op elkaar gepakte laminaire structuren van hartspiercellen en ondersteunende weefsels zijn gerangschikt in spiraalvormige patronen in de hartwand 18,19. Het hart is ook elektromechanisch gekoppeld 20 in een sterk gecoördineerde manier om het bloed efficiënt te werpen op het lichaam 21. Verschillende grote hindernissen die moeten worden aangepakt, maar voordat de natuur ingewikkelde ontwerp betrouwbaar kan worden samengevat in vitro.Eerste, hoewel robuuste hartspierceldifferentiatie methoden verder worden ontwikkeld 22 HPSC-CMs vertonen nog vrij onvolwassen fenotypes. Hun elektromechanische eigenschappen en morfologie meest overeenkomen met foetale niveaus 23. Ten tweede, wanneer bewaard in de traditionele cultuur omstandigheden, zowel stamcellen afgeleide en primaire cardiomyocyten niet samenvoegen tot inheemse, weefsel-achtige structuren. Integendeel, cellen willekeurig georiënteerd en niet vertonen de gestreepte staafvormige uiterlijk van volwassen myocard 24.
De extracellulaire matrix (ECM) omgeving waarmee cellen interageren speelt een belangrijke rol in talrijke cellulaire processen 11,13,25. De ECM bestaat uit complexe, goed gedefinieerde moleculaire en topografische signalen die aanzienlijk beïnvloeden de structuur en functie van cellen 6,26. In het hart, cellulaire uitlijning volgt de onderliggende nanometerschaal ECM vezels 2. De impact van deze nanotopographsche signalen op cellen en weefsels functie echter verre van volledig begrepen. Voorstudies van nanometerschaal cel-biomateriaal interactie geven het potentiële belang en de impact van sub-micron topografische aanwijzingen voor celsignalerende 27, adhesie 28-30, groei 31, en differentiatie 32,33. Vanwege de moeilijkheden bij het ontwikkelen reproduceerbare en schaalbare nanofabricated substraten, deze studies konden de meerschalige cellulaire effecten van de in vivo omgeving ECM reproduceren. In dit protocol wordt een eenvoudige en kosteneffectieve nanofabricage techniek om celkweek steigers nabootsen inheemse cardiale ECM vezeluitlijnblok produceren beschreven, waardoor een breed scala van nieuwe onderzoeken van cardiomyocyte-biomateriaal interacties. Begrijpen hoe hartspiercellen interactie met de nanoschaal ECM-omgeving kan zorgen voor de mogelijkheid om cellulaire gedrag te controleren nauwer mimic inheemse weefsel functie. Bovendien celmonolagen zijn een vereenvoudigde experimenteel systeem in vergelijking met 3D-structuren, maar toch vertonen complexe multi-cellulaire gedrag voor inzichtelijke onderzoeken en functionele screening 2,34-36. Tenslotte kunnen dergelijke steigers worden gebruikt om cellulaire transplantaatfunctie verbeteren wanneer geïmplanteerd in het hart voor regeneratieve doeleinden 37.
Protocol
Representative Results
Discussion
Functioneel volwassen hartweefsel ontbreken zowel in vivo als in vitro toepassingen van cardiale tissue engineering. De CFL nanofabricage hier beschreven methoden zijn robuust technieken voor het bereiken van cellulaire aanpassing en beïnvloeding macroscopische weefselfunctie vanwege de schaalbaarheid van het systeem. Grote gebieden kunnen gemakkelijk worden gevormd en gebruikt voor celkweek. Macroscopische cellulaire uitlijning is belangrijk in hartweefsel techniek om biomimetische, functionele weefs…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
Referenzen
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Kim, D. -. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
- Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
- Lü, J. -. M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
- Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
- Kim, D. -. H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
- Park, J., Kim, H. -. N., Kim, D. -. H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
- Kim, D. -. H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -. M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
- Kim, D. -. H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
- Kim, D. -. H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
- Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
- Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
- Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
- Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
- Mohrman, D. E., Heller, L. J. . Cardiovascular Physiology. , (2010).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
- Qian, J. -. Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
- You, M. -. H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
- Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
- Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
- Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
- Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
- Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
- Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
- Park, J., Bauer, S., Mark, v. o. n. . d. e. r. . K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
- Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
- Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
- Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
- Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
- Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
