Capillaire de travail lithographie pour l'ingénierie tissulaire cardiaque
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
Les maladies cardiovasculaires demeurent la principale cause de décès dans le monde 1. L'ingénierie tissulaire cardiaque est très prometteur pour livrer découvertes médicales révolutionnaires avec les objectifs de développement de tissus fonctionnels pour la régénération cardiaque ainsi que des tests de dépistage in vitro. Cependant, la capacité de créer des modèles haute-fidélité de tissu cardiaque s'est avéré difficile. Matrice extracellulaire du cœur (ECM) est une structure complexe composée de deux signaux biochimiques et biomécaniques allant de la micro à l'échelle du nanomètre 2. Les conditions locales de chargement mécanique et les interactions cellule-ECM ont été récemment reconnus comme des composantes essentielles de l'ingénierie du tissu cardiaque 3-5.
Une grande partie de l'ECM cardiaque est composé de fibres de collagène alignées avec des diamètres à l'échelle nanométrique, qui influe de manière significative l'architecture tissulaire et de couplage électromécanique 2. Malheureusement, peu de méthodes VHAe été capable d'imiter l'organisation des fibres de l'ECM vers le bas à l'échelle du nanomètre. Les récents progrès dans les techniques de nanofabrication, cependant, ont permis la conception et la fabrication d'échafaudages évolutifs qui imitent les indices de rigidité vivo dans structurelles et substrat de l'ECM dans le coeur 6-9.
Nous présentons ici le développement de deux reproductible, les processus de nanostructuration évolutives pour l'alignement fonctionnel des cellules cardiaques en utilisant le poly biocompatible de polymère (lactide-co-glycolide) (PLGA) 8 et un polyuréthane (PU) polymère à base de coût-efficacité, et. Ces substrats anisotrope nanofabricated (ANF) imitent l'ECM sous-jacente de bien organisées, tissus alignés et peut être utilisé pour étudier le rôle de nanotopographie sur la morphologie et la fonction cellulaire 10-14.
L'utilisation d'un nanostructurés (NP) maître de silicium comme un modèle, un acrylate de polyuréthane (PUA) moule est fabriqué. Ce moule de PUA est ensuite utilisé pour pattern l'hydrogel PU ou PLGA via, assistée UV ou force capillaire solvant médiation lithographie (CFL), respectivement 15,16. En bref, PU ou PLGA pré-polymère est goutte distribuée sur une lamelle de verre et le moule PUA est placé sur le dessus. Pour assistée par UV LCF, l'unité centrale est ensuite exposée à un rayonnement UV (λ = 250 à 400 nm) pour le durcissement. Pour solvant médiation de la LCF, la PLGA est gravé en utilisant la chaleur (120 ° C) et de pression (100 kPa). Après durcissement, le moule PUA est décollée, laissant derrière lui un ANF pour la culture cellulaire. Les cellules primaires, tels que néonatales myocytes ventriculaires de rats, ainsi que les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines, peuvent être maintenus sur le ANF 2.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde et de présenter un fardeau socio-économique de poids sur un 1,17 de système de santé mondial déjà tendu. L'ingénierie tissulaire cardiaque a deux objectifs distincts: (1) pour régénérer le myocarde endommagé après une maladie ischémique ou d'une cardiomyopathie ou (2) pour créer un modèle de haute fidélité de cœur pour criblage in vitro de la drogue ou de la modélisation de la maladie.
Le cœur est un organe complexe qui doit travailler constamment à fournir sang dans le corps. Structures laminaires denses de cardiomyocytes et de tissus de soutien sont disposés dans les modèles hélicoïdaux tout au long de la paroi du coeur 18,19. Le cœur est également électromécanique couplé 20 de manière très coordonnée pour éjecter efficacement le sang dans le corps 21. Plusieurs obstacles majeurs restent à relever, cependant, avant la conception complexe de la nature peut être récapitulé de manière fiable in vitro.Tout d'abord, bien que les méthodes de différenciation des cardiomyocytes solides continuent à être développés 22, HPSC-CM exposer encore phénotypes plutôt immatures. Leurs propriétés électromécaniques et morphologie correspondent plus étroitement les niveaux foetus 23. Deuxièmement, lorsqu'il est conservé dans des conditions de culture traditionnelle, à la fois des cellules souches dérivées et cardiomyocytes primaires ne parviennent pas à monter dans les structures indigènes, tissus, etc. Au contraire, les cellules deviennent orientés de façon aléatoire et ne présentent pas l'aspect en forme de tige bandes de myocarde adulte 24.
La matrice (ECM) environnement extracellulaire avec laquelle les cellules interagissent joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires 11,13,25. L'ECM est constitué de signaux moléculaires et topographiques complexes, bien définis qui influencent de manière significative la structure et la fonction des cellules 6,26. Dans le coeur, l'alignement cellulaire suit de près les fibres d'ECM à l'échelle du nanomètre sous-jacente 2. L'impact de ces nanotopographindices iCal sur la fonction cellulaire et tissulaire, cependant, est loin d'être entièrement comprise. Des études préliminaires de l'interaction cellule-biomatériau échelle nanométrique indiquent l'importance et l'impact potentiel de sous-micron repères topographiques pour la signalisation 27 cellulaire, l'adhérence 28-30, une croissance de 31, et la différenciation 32,33. Toutefois, en raison de la difficulté à développer des substrats nanofabricated reproductibles et évolutives, ces études n'ont pas pu reproduire les effets cellulaires multi-échelle du complexe dans un environnement ECM vivo. Dans ce protocole, une technique de nano-fabrication simple et rentable à produire des échafaudages de culture cellulaire mimant l'alignement des fibres de l'ECM cardiaque native est décrite, ce qui permet une large gamme de nouvelles recherches sur les interactions des cardiomyocytes biomatériau. Comprendre comment les cardiomyocytes interagissent avec l'environnement ECM à l'échelle nanométrique pourrait permettre la possibilité de contrôler le comportement cellulaire de plus simulent étroitement la fonction de tissu natiftion. En outre, des monocouches de cellules sont un système expérimental simplifié par rapport à des structures 3D, mais encore ont un comportement multi-cellulaire complexe pour les enquêtes pertinentes et criblage fonctionnel 2,34-36. Enfin, ces échafaudages pourraient être utilisés pour améliorer la fonction du greffon cellulaire lorsqu'ils sont implantés dans le cœur des fins de régénération 37.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tissus cardiaques fonctionnellement matures font défaut à la fois in vivo et in vitro dans des applications de l'ingénierie de tissu cardiaque. Les méthodes de nanofabrication de la LCF décrits ici sont des techniques fiables pour la réalisation de l'alignement cellulaire et d'influencer la fonction des tissus macroscopique en raison de l'évolutivité du système. De vastes zones peuvent être facilement modelé et utilisés pour la culture cellulaire. Alignement cellula…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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