单分子成像的基因调控<em在体内</em使用转位激活裂解（CoTrAC）
Summary
我们描述的荧光显微镜法，共翻译激活由裂解（CoTrAC），对图像的生产与单分子的精确度不扰动的蛋白质的功能的情况下，在活细胞中的蛋白质分子。此方法已被用于按照随机表达动力学的一种转录因子，λ阻遏CI<sup> 1</sup>。
Abstract
我们描述的荧光显微镜法，共翻译激活由裂解（CoTrAC）图像与单分子的精确度不扰动的蛋白质的功能的情况下，在活细胞中的蛋白质分子的生产。此方法使得能够顺序，五分钟的时间窗期间在一个小区中产生的蛋白质分子的数目进行计数。它需要一个与激光激发功率密度为约0.5至1千瓦/厘米2，这是足够敏感的检测单一的荧光蛋白在活细胞中的分子的荧光显微镜。在此方法中所使用的荧光报道，由三部分组成：膜击靶序列，一个快速成熟的，黄色荧光蛋白和蛋白酶识别序列。记者感兴趣的蛋白质的N-末端的翻译融合。细胞生长在一个温度控制的显微镜载物台上。每五分钟后，细胞内的荧光分子成像（以及后来的合作unted通过分析荧光图像），并随后photobleached让只有新翻译的蛋白质在接下来的测量计数。
，此方法产生的荧光图像，可以通过检测在每个图像中，将它们分配到单个细胞的荧光斑点，然后分配的细胞谱系的细胞进行分析。的数目计算出一个时间窗口内的一个给定的细胞产生的蛋白质的是，集成的斑点的荧光强度除以由单个荧光分子的平均强度。我们用这种方法测量的0-45的分子在单5分钟时间窗的范围中的表达水平。这种方法使我们能够测量噪声的λ阻遏CI的表达，并在系统生物学中有许多其他潜在的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
CoTrAC方法可以推广到测量生产的常规的N-或C-末端的荧光蛋白融合的其它蛋白质，可能会破坏蛋白质的活性。 CoTrAC战略有三个独特的优势，目前的方法。首先，合作翻译融合确保为每个感兴趣的蛋白质分子的，一个分子中的荧光报道产生，允许实时蛋白质生产的准确计数。其次，膜 – 定位记者TSR-金星使荧光记者的单分子检测，从而能够检测在非常低的水平表达的蛋白质。第三和最重要的是，中的…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
的的质粒pCG001表达Ubp1好心提供的罗汉贝克在约翰·科廷学校的医学研究。这项工作是由of Dimes的研究资助，2011财年3月，3月Dimes的瓦西里·奥康纳入门学术研究奖＃5-FY20和美国国家科学基金会职业奖0746796。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
Referenzen
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