Singola molecola di imaging del regolamento Gene<em> In vivo</em> Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)
Summary
Descriviamo un metodo di microscopia a fluorescenza, Co-traslazionale di attivazione da Cleavage (CoTrAC), per l'immagine della produzione di molecole di proteine in cellule vive con singola molecola di precisione senza perturbare la funzionalità della proteina. Questo metodo è stato utilizzato per seguire la dinamica stocastica espressione di un fattore di trascrizione, il repressore λ CI<sup> 1</sup>.
Abstract
Descriviamo un metodo di microscopia a fluorescenza, Co-traslazionale di attivazione da Cleavage (CoTrAC) per l'immagine della produzione di molecole di proteine in cellule vive con singola molecola di precisione senza perturbare la funzionalità della proteina. Questo metodo permette di contare il numero di molecole di proteine prodotte in una cella durante sequenziali, cinque minuti finestre temporali. Si richiede un microscopio a fluorescenza con densità di potenza laser di eccitazione di ~ 0,5 a 1 kW / cm 2, che è sufficientemente sensibile per rivelare singole molecole di proteine fluorescenti in cellule vive. Il reporter fluorescente utilizzata in questo metodo si compone di tre parti: una sequenza di targeting membrana, una rapida maturazione, proteina fluorescente gialla e una sequenza di riconoscimento proteasi. Il reporter è traduzionalmente fusa all'N-terminale di una proteina di interesse. Le cellule vengono coltivate su un temperatura controllata portaoggetti. Ogni cinque minuti, le molecole fluorescenti all'interno delle cellule vengono esposte (e poi counted analizzando le immagini di fluorescenza) e, successivamente, in modo che le proteine photobleached solo appena tradotti sono conteggiati nella misura successiva.
Immagini di fluorescenza risultanti da tale metodo può essere analizzato rilevando macchie fluorescenti in ogni immagine, assegnando loro singole celle e quindi assegnare cellule per linee cellulari. Il numero di proteine prodotte entro una finestra temporale in una data cella è calcolato dividendo l'intensità di fluorescenza delle macchie integrato per l'intensità media di singole molecole fluorescenti. Abbiamo usato questo metodo per misurare i livelli di espressione nella gamma di 0-45 molecole in finestre singole 5 min di tempo. Questo metodo consente di misurare il rumore nell'espressione del repressore λ CI, e ha molte altre applicazioni potenziali in biologia dei sistemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo CoTrAC può essere generalizzato per misurare la produzione di altre proteine con N-convenzionali o C-terminali fusioni proteine fluorescenti possono alterare l'attività della proteina. La strategia CoTrAC ha tre vantaggi unici rispetto ai metodi attuali. First, co-traslazionale fusione assicura che una molecola del reporter fluorescente viene prodotta per ogni molecola di proteina di interesse, permettendo conteggio preciso della produzione di proteina in tempo reale. In secondo luogo, la mem…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il pCG001 plasmide che esprime Ubp1 è stato gentilmente fornito da Rohan Baker presso la John Curtin School of Medical Research. Questo lavoro è stato finanziato dal March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Research Scholar Award Starter N ° 5-FY20 e di aggiudicazione CARRIERA NSF 0746796.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
Referenzen
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