Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

Summary

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Abstract

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een veel gebruikte methode voor het bepalen van de interacties van verschillende eiwitten met DNA in chromatine van levende cellen. Voorbeelden zijn sequentie-specifieke DNA bindende transcriptiefactoren, histonen en hun verschillende wijzigingen staten, enzymen zoals RNA polymerasen en bijkomende factoren en DNA repair onderdelen. Ondanks de alomtegenwoordigheid, er is een gebrek aan up-to-date en gedetailleerde methoden voor zowel bank voorbereiding van materiaal en voor de nauwkeurige analyse toestaan ​​kwantitatieve metrics van interactie. Door dit gebrek aan informatie en ook omdat, zoals elke immunoprecipitatie voorwaarden wordt opnieuw geoptimaliseerd voor nieuwe sets experimentele omstandigheden, de ChIP assay is gevoelig voor fouten of slecht kwantitatieve resultaten.

Ons protocol is uiteindelijk afgeleid van baanbrekende werk op transcriptiefactor: DNA interacties ^1,2, maar bevat een aantal verbeteringen aan sensibilisatieviteit en reproduceerbaarheid voor moeilijk te verkrijgen celtypen. Het protocol is met succes gebruikt ^3,4, beide met qPCR DNA verrijking kwantificeren, of met een semi-kwantitatieve variant van de volgende protocol.

Deze kwantitatieve analyse van PCR-geamplificeerde materiaal computationeel uitgevoerd en vormt een obstakel in het assay. Belangrijke controles en andere overwegingen omvatten het gebruik van een isotype-gematchte antilichaam en evaluatie van een controlegebied van genomisch DNA, zoals een intergene gebied niet voorspeld door het bestuderen eiwit (of verwacht te worden gebonden niet wijzigingen vertonen onder de experimentele omstandigheden). Daarnaast wordt een standaard curve van het uitgangsmateriaal voor elke chip monster van absolute niveau van verrijking leiden in het proefmateriaal. Gebruik van standaard curves helpt rekening met verschillen tussen de primer sets, ongeacht hoe goed ze zijn ontworpen, en ook verschillen efficiencyschillen hele reeks template concentraties voor een enkele primer set. Ons protocol is anders dan anderen die beschikbaar zijn ^5-8 in dat we uitgebreid aan de latere, analysefase.

Protocol

1. Isolatie van Mouse milt Naïeve CD4 T-cellen Offer van de muis op een humane manier die overeenkomt met Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) protocollen. Ontleden de milt en het in petrischaal met 10 ml DMEM met 10% FBS. Plet de milt met matte uiteinden van twee glasplaatjes aan de splenocyten los. Breng de celsuspensie in een 15 ml conische buis. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 200 xg (~ 1200 rpm voor een klinische centrifuge met een typische diameter rotor) ge…

Representative Results

De Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) protocol hier gepresenteerde regelaars voor eventuele verschillen in de hoeveelheid DNA in PCR door het gebruik van een primerpaar dat ongebonden regio genoom versterkt, dus dienen als een "loading control". In het in figuur 3 hebben we bijvoorbeeld het coderende gebied van het muizen ACTB gen als een regio gebonden aan onze proteïne van interesse en de transcriptiefactor NFAT bindingsplaats op muis IL2 promoter als doelregio. Als alte…

Discussion

Het protocol biedt boven een robuuste methode nauwkeurig kwantificeren van DNA verrijking van primaire lymfocyten met chip. Een belangrijke reden robuustheid dit protocol is het opnemen van biologische repliceert. Het bovenstaande protocol gebruikt drie duplo, de verrijking waarvoor wordt onafhankelijk berekend. De uitgangen worden vervolgens gemiddeld om de verrijking en standaarddeviaties berekend dat een maat voor de variabiliteit te verstrekken. Voor elk monster drie technische replicaten worden ook uitgevoerd om de…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
			Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
			Table of Equipment