Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Summary

Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.

Abstract

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der Wechselwirkungen verschiedener Proteine ​​mit DNA in Chromatin lebender Zellen. Beispiele umfassen sequenzspezifische DNA-bindende Transkriptionsfaktoren, Histone und ihre verschiedenen Modifikationen Zustände, Enzyme, wie RNA-Polymerasen und zugehörige Faktoren und DNA-Reparatur-Komponenten. Trotz seiner Allgegenwart, gibt es einen Mangel an up-to-date, detaillierte Methoden sowohl für Bank Vorbereitung des Materials und für die genaue Analyse ermöglicht quantitative Metriken der Interaktion. Durch diesen Mangel an Informationen, und auch, weil, wie jeder Immunpräzipitation Bedingungen müssen für neue Sätze von experimentellen Bedingungen neu optimiert werden kann, ist der Chip-Assay anfällig für fehlerhafte oder schlecht quantitative Ergebnisse.

Unser Protokoll wird schließlich vom bahnbrechenden Arbeiten auf Transkriptionsfaktor abgeleitet: DNA-Wechselwirkungen ^1,2, sondern beinhaltet eine Reihe von Verbesserungen an Sensibilisierungvity und Reproduzierbarkeit für schwer zu erhalten Zelltypen. Das Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, ^3,4, beide unter Verwendung von DNA-qPCR Bereicherung quantifizieren, oder mit Hilfe eines semi-quantitative Variante des unter Protokoll.

Diese quantitative Analyse der PCR-amplifizierten Materials rechnerisch durchgeführt und stellt einen begrenzenden Faktor in dem Assay. Wichtige Kontrollen und andere Überlegungen schließen die Verwendung eines Isotyp-Antikörper, sowie Auswertung einer Kontrolle Region von genomischer DNA, wie ein Zwischengenregion vorhergesagt nicht durch das Protein unter Studie (oder erwartet gebunden werden keine Änderungen unter zeigen die experimentellen Bedingungen). Darüber hinaus wird eine Standardkurve von Vormaterial für jeden Span Probe zur Ableitung absoluten Werte der Anreicherung im experimentellen Material. Verwendung von Standard-Kurven hilft zur Berücksichtigung von Unterschieden zwischen Primer-Sets nehmen, unabhängig davon, wie vorsichtig sie sind entworfen, und auch Effizienz unterscheidenschiede über den Bereich der Template-Konzentrationen für eine Primer-Set. Unser Protokoll ist anders als die anderen, die verfügbar sind ^5-8 in die wir ausgiebig decken die später Analysephase.

Protocol

1. Isolation von Maus Milz Naive CD4 T-Zellen Aufopferung der Maus auf humane Weise im Einklang mit Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Protokolle. Präparieren Sie die Milz und legen Sie es in Petrischale mit 10 ml DMEM mit 10% FBS. Crush die Milz mit mattierten Enden von zwei Glasplatten, die Splenozyten freizugeben. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen. Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg (~ 1.200 UpM einer klinischen Zentr…

Representative Results

Das Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)-Protokoll hier vorgestellten Steuerungen für Unterschiede, wenn überhaupt, in der Höhe von DNA in der PCR durch die Verwendung eines Primer-Paar, das ein ungebundenes Region Genom verstärkt eingesetzt und dienen somit als "Ladekontrolle". In dem Beispiel in 3 gezeigt ist, haben wir die kodierende Region des Maus istB Gen als eine Region in unseren ungebundenes Protein von Interesse und des Transkriptionsfaktors NFAT Bindungsstelle auf Maus…

Discussion

Das Protokoll über eine robuste Methode zur Quantifizierung von DNA genau Anreicherung von primären Lymphozyten mit ChIP. Ein wichtiger Grund für Robustheit in diesem Protokoll ist die Aufnahme der biologischen Replikate. Die obige Protokoll verwendet drei Wiederholungen, die Anreicherung, für die unabhängig berechnet. Die Ausgänge werden dann gemittelt, um einen Grad der Anreicherung und Standardabweichungen berechnet, um ein Maß der Variabilität bereitzustellen. Für jede Probe repliziert drei technischen auch…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
			Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
			Table of Equipment