Découpe au cryostat Communautés de levure pour examen des caractéristiques de fluorescence
Summary
Nous présentons un protocole de congélation et de découpe au cryostat communautés de levure pour observer les modèles internes de cellules fluorescentes. La méthode repose sur la fixation et le méthanol octobre-enrobage à préserver la répartition spatiale des cellules sans inactivation des protéines fluorescentes dans une communauté.
Abstract
Les microbes vivent généralement dans les communautés. L'organisation spatiale des cellules à l'intérieur d'une communauté est censé avoir un impact sur la survie et la fonction de la communauté 1. Techniques optiques de sectionnement, y compris la microscopie confocale et biphotonique, se sont avérées utiles pour observer l'organisation spatiale des communautés bactériennes et Archaea 2,3. Une combinaison de la microscopie confocale et sectionnement physique de colonies de levures a révélé organisation interne des cellules 4. Cependant, directe sectionnement optique en utilisant la microscopie confocale ou à deux photons a été seulement en mesure d'atteindre quelques couches cellulaires profondes dans les colonies de levures. Cette limitation est probablement en raison de forte diffusion de la lumière à partir de 4 cellules de levure.
Ici, nous présentons une méthode basée sur la fixation et découpe au cryostat à obtenir la distribution spatiale des cellules fluorescentes au sein des communautés de Saccharomyces cerevisiae. Nous utilisons le méthanol comme agent fixateurà préserver la répartition spatiale des cellules. Communautés fixes sont infiltrés par composé OCT, congelés et cryosectioned dans un cryostat. L'imagerie par fluorescence des sections révèle l'organisation interne des cellules fluorescentes sein de la communauté.
Des exemples de communautés de levures consistant en souches exprimant rouges et verts protéines fluorescentes en évidence les potentialités du procédé découpe au cryostat pour révéler la distribution spatiale des cellules fluorescentes ainsi que celui de l'expression des gènes dans les colonies de levure 2,3. Même si notre accent a été mis sur les communautés de Saccharomyces cerevisiae, la même méthode peut potentiellement être utilisée pour examiner les autres communautés microbiennes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procédure présentée ici offre un moyen d'inspecter la structure interne des communautés de levure. L'étape de fixation méthanol rend la colonie de levure rigide 8 et préserve l'intégrité de la colonie, mais il provoque aussi le point 8 de retrait qui doit être pris en compte dans l'interprétation des résultats. Nous observons habituellement autour de 30% de rétrécissement dans la hauteur de colonies de levures, par rapport aux colonies directement intégrés dans un…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Jonathan Cooper Lab au Fred Hutchinson Cancer Research Center for la permission d'utiliser leur cryostat. Ce travail a été soutenu par le NIH et la WM Keck Foundation. BM est un garçon Gordon et Betty Moore Foundation de la recherche Sciences de la Vie. Nous sommes reconnaissants à Daniel Gottschling pour avoir partagé son protocole de fixation avec nous.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
Referenzen
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