Cryosectioning Comunidades levadura para examinar los patrones de fluorescencia

Summary

Se presenta un protocolo para la congelación y cryosectioning comunidades levadura para observar los patrones internos de las células fluorescentes. El método se basa en la fijación de metanol y OCT-incrustación de preservar la distribución espacial de las células sin inactivar proteínas fluorescentes dentro de una comunidad.

Abstract

Los microbios suelen vivir en las comunidades. La organización espacial de las células dentro de una comunidad que se cree un impacto en la supervivencia y la función de la comunidad ^1. Ópticos técnicas de seccionamiento, incluyendo microscopía confocal y dos fotones, han demostrado ser útiles para la observación de la organización espacial de las comunidades bacterianas y archaeal ^2,3. Una combinación de imagen confocal y seccionamiento físico de colonias de levaduras ha revelado la organización interna de las células ^4. Sin embargo, el seccionamiento óptico directo por microscopía confocal o dos fotones sólo ha sido capaz de llegar a las capas celulares de profundidad en algunas colonias de levaduras. Esta limitación es probable debido a la dispersión de luz intensa a partir de ⁴ células de levadura.

Aquí, se presenta un método basado en la fijación y crioseccionamiento para obtener la distribución espacial de las células fluorescentes dentro de las comunidades de Saccharomyces cerevisiae. Usamos metanol como agente fijadorpara preservar la distribución espacial de las células. Comunidades fijos se infiltró con el compuesto OCT, congelado, y cryosectioned en un criostato. Imágenes de fluorescencia de las secciones revela que la organización interna de las células fluorescentes dentro de la comunidad.

Ejemplos de comunidades de levadura que consisten en cepas que expresan proteínas fluorescentes rojas y verdes demostrar el potencial del método cryosectioning para revelar la distribución espacial de las células fluorescentes, así como el de la expresión de genes dentro de las colonias de levadura ^2,3. Aunque nuestra atención se ha centrado en las comunidades de Saccharomyces cerevisiae, el mismo método que potencialmente se pueden aplicar a examinar otras comunidades microbianas.

Protocol

1. La fijación de Comunidades de levadura Grow comunidades de levadura en un filtro de membrana (por ejemplo, Millipore filtro de membrana MF; Figura 2A). Este protocolo corresponde a una comunidad típica de menos de 2×10 8 células sobre un filtro de membrana de 6 mm de diámetro. Utilice un trozo de papel de filtro Whatman 541 para cubrir la parte inferior de un 1 cm de diámetro pozo (Figura 2B). Este papel Whatman se usa como portador para …

Representative Results

Fluorescencia imágenes de secciones transversales verticales de las comunidades de levadura que contienen rojo y verde-etiquetados poblaciones competitivos 6 se muestran en la Figura 3. Estas comunidades constan de dos cepas prototróficas de levadura y su competencia por los recursos compartidos, incluyendo el espacio, conduce a patrones columnar 7, como se muestra en sus secciones transversales verticales. Resoluciones de hasta una sola célula se pueden resolver en las seccione…

Discussion

El procedimiento presentado aquí ofrece una manera de inspeccionar la estructura interna de las comunidades de levadura. La etapa de fijación de metanol hace que la colonia de levadura rígido ⁸ y preserva la integridad de la colonia, sin embargo, también provoca la contracción ⁸ que deben tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados. Normalmente vemos alrededor del 30% de contracción en la altura de las colonias de hongos, en comparación con las colonias directamente embebidos e…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
100% Methanol	J.T. Baker	9070-01
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Andwin Scientific	4583
Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper	Whatman	1541-047
Millipore-MF Membrane Filter	Millipore	HAWP04700
Cryostat	Leica	CM 1510 S