Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

Summary

Um protocolo de novo para a preparação de suspensões de células mecânica testiculares roedor a partir de material, evitando enzimas e detergentes, é descrito. O método é muito simples, rápida, reprodutível e processa boas suspensões de células de qualidade, os quais são adequados para a separação do fluxo e extracção de RNA.

Abstract

Testículos mamíferos são órgãos muito complexos que contêm mais de 30 diferentes tipos de células, incluindo as células testiculares somáticas e diferentes estágios de células germinativas. Esta heterogeneidade é uma desvantagem importante em relação ao estudo das bases da espermatogénese mamíferos, visto que são necessárias populações puras ou enriquecidas de células em determinadas fases do desenvolvimento do esperma para a maioria das análises moleculares ^1.

Várias estratégias, tais como Staput ^{2,3, uma} elutriação centrífuga, e por citometria de fluxo (FC) ^{de 4,5} foram utilizados para a obtenção de populações de células testiculares enriquecida ou purificada, a fim de permitir que os estudos de expressão diferencial de genes.

Exige-se que as células estão em suspensão para a maioria das abordagens de enriquecimento / purificao. Idealmente, a suspensão de células seja representativo do tecido original, possuem uma elevada proporção de células viáveis ​​e alguns multinucleates – que tendem a formar por causa donatureza sincicial do epitélio seminífero ^6,7 – e aglomerados de células falta ^um. Relatórios anteriores evidenciaram que as suspensões de células testiculares preparados por um método exclusivamente mecânica agregada mais facilmente do que os tripsinizados ^1. Por outro lado, os tratamentos enzimáticos com ARNases e / ou desagregação das enzimas como a tripsina e a colagenase, levar à deterioração macromoléculas específicas, o que é indesejável em certas aplicações a jusante. O processo ideal deveria ser tão curto quanto possível e envolvem manipulação mínima de modo a conseguir uma boa conservação das macromoléculas de interesse, tal como ARNm. Protocolos actuais para a preparação de suspensões de células a partir de tecidos sólidos são geralmente demorados, altamente dependente do operador, e podem danificar selectivamente certos tipos de células ^1,8.

O protocolo aqui apresentado combina as vantagens de uma desagregação mecânica altamente reprodutível e extremamente breve com o umbsence de tratamento enzimático, que conduz a boas suspensões de células de qualidade que possam ser utilizados para a análise por citometria de fluxo e a triagem ^4, e os estudos de expressão de genes posteriores ^9.

Protocol

1. Preparação de suspensões de células Sacrificar o espécime a ser utilizado seguindo as recomendações das comissões especializadas, como IACUC ou equivalente (no Uruguai, Comissão Nacional de Experimentação Animal [CNEA]). No nosso caso, uma dose excessiva de pentobarbital foi administrada. Dissecar testículos seguindo procedimentos padrão aprovados e colocá-los num copo 96 milímetros de Petri em gelo, contendo 10 ml de DMEM gelada suplementada com soro de vitela fetal a 10%. <l…

Representative Results

Um exemplo de uma suspensão de células bem desagregada preparados a partir de testículos de ratos com o protocolo aqui descrito é mostrado na Figura 1. Em comparação com os tratamentos enzimáticos 6,8 a desagregação e a métodos mecânicos descritos anteriormente 2, o que foi apresentado aqui é muito mais rápido, envolve menos manuseamento, é facilmente reprodutível (não dependente do operador), os detritos celulares e torna escassa (espec…

Discussion

O método descrito aqui optimizado permite a preparação de suspensões de células a partir de tecido testicular de roedores de um modo muito rápido e reprodutível, evitando o tratamento enzima e detergente e de manter uma boa integridade da célula e tipo proporções. A brevidade do procedimento (a 15 min extensão inclui dissecção testículo, corte de tecido, e transformação), envolva um mínimo de manipulação, e na ausência de tratamentos enzimáticos são algumas das principais vantagens. Todas estas rep…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml