Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares
Summary
Se describe un nuevo protocolo para la preparación mecánica de suspensiones de células testiculares de material de roedor, evitando enzimas y detergentes,. El método es muy simple, rápido, reproducible, y hace que las suspensiones de células de buena calidad, que son adecuados para la clasificación de flujo y la extracción de RNA.
Abstract
Testículos de mamíferos son órganos muy complejos que contienen más de 30 tipos diferentes de células, incluyendo las células somáticas testiculares y las diferentes etapas de las células germinales. Esta heterogeneidad es un inconveniente importante relación con el estudio de las bases de la espermatogénesis de mamíferos, ya que se necesitan poblaciones de células puros o enriquecidos en ciertas etapas del desarrollo de los espermatozoides para la mayoría de los análisis moleculares 1.
Varias estrategias tales como Staput 2,3, elutriación centrífuga 1, y citometría de flujo (FC) 4,5 se han empleado para obtener poblaciones de células testiculares enriquecidos o purificados con el fin de permitir a los estudios de expresión génica diferencial.
Se requiere que las células están en suspensión para la mayoría de los enfoques de enriquecimiento / purificación. Idealmente, la suspensión celular será representativo del tejido original, tienen una alta proporción de células viables y unos multinucleates – que tienden a formar debido a lasincitial naturaleza del epitelio seminífero 6,7 – y grupos de células falta 1. En informes anteriores habían evidenciado que las suspensiones de células testiculares preparados por un método exclusivamente mecánica agrupados más facilidad que las tratadas con tripsina 1. Por otra parte, los tratamientos enzimáticos con RNAsas y / o enzimas disgregantes como tripsina y la colagenasa conducen a la degradación de macromoléculas específica, lo cual es indeseable para ciertas aplicaciones industriales. El proceso ideal debe ser tan corta como sea posible e implicar un mínimo de manipulación, a fin de lograr una buena conservación de las macromoléculas de interés, tales como ARNm. Los protocolos actuales para la preparación de suspensiones de células de tejidos sólidos son por lo general mucho tiempo, altamente dependiente del operador, y pueden dañar selectivamente ciertos tipos de células 1,8.
El protocolo presentado aquí combina las ventajas de una desagregación mecánica altamente reproducible y extremadamente breve con la unabsence de tratamiento enzimático, que conduce a suspensiones de células de buena calidad que se pueden utilizar para análisis de citometría de flujo y clasificación 4, y ulteriores estudios de expresión génica 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método optimizado descrito aquí permite la preparación de suspensiones de células a partir de tejido testicular roedor de una manera muy rápida y reproducible, evitando enzima y detergente tratamiento y mantener una buena integridad de la célula y las proporciones de tipo. La brevedad del procedimiento (el lapso de 15 min incluye disección testículo, corte de tejido, y el procesamiento), la manipulación mínimos correspondientes, y la ausencia de tratamientos enzimáticos son algunas de las principales venta…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por el CSIC (I + D del proyecto C022) y PEDECIBA. Los autores desean agradecer a Mariela Bollati y Valentina Porro de la Unidad de Biología Celular (Institut Pasteur de Montevideo) por su generosa colaboración relativo a la clasificación de células MoFlo y Merial-Montevideo para proporcionar gentilmente todos los ejemplares de cuyes utilizados en este proyecto. Figura 1 se reproducen con autorización de BioMed Central, las figuras 2 y 3, y en la Tabla 1 con el permiso de S. Karger AG, Basilea, y las figuras 4 y 5 fueron reproducidas o adaptadas con permiso de John Wiley & Sons, Inc (copyright propiedad de Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
Referenzen
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