동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경
Summary
우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo – 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.
Abstract
cryo – 전자 단층 촬영 (cryoET은) 근접에 생리적 상태 1 분자 해상도의 세포 구조의 3D 시각화 할 수 있습니다. 그러나 cryoET와 숙주 세포 환경에서 각각의 바이러스 복합체의 직접 시각화는 특히 HIV-1의 경우, 바이러스 성 항목의 자주와 동적 인 특성으로 인해, 2 도전합니다. 시간 경과 라이브 세포 이미징 HIV-1 3-7 라이프 사이클의 여러 측면에 대한 정보의 큰 거래를 굴복 동안, 해상도는 살아있는 세포 현미경으로 여유가 (~ 200 nm의) 제한됩니다. 우리의 작품은 살아있는 세포 형광 현미경을 결합내는 형광 현미경 및 cryoET에 의해 HIV-1 감염의 초기 사건의 직접적인 시각화를 허용하는 상관 관계 방법을 개발을 목표로 하였다. 이러한 방식으로, 라이브 셀내는 형광 신호를 정확하게 cryoET에서 샘플링을 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 구조 정보는 cryoET 수 있습니다 B에서 얻은동적 기능을 데이터로 보완 전자 형광 표지 대상의 라이브 세포 이미징을 통해 얻은.
이 비디오 문서에서는, 우리는 구조 HIV-1의 조사 및 3D 상호 고속 라이브 세포 이미징 및 고해상도 cryoET 구조 분석을 사용하여 호스트 세포 상호 작용에 대한 자세한 방법과 프로토콜을 제공합니다. HIV-1 입자에 감염 헬라 세포는 공 촛점 살아있는 세포 현미경으로 첫 번째 특징하였고, 같은 바이러스 성 입자를 포함하는 영역은 다음 차원 구조 자세한 내용은 cryo – 전자 단층 촬영을 이용하여 분석 하였다. 영상 데이터, 광학 이미징 및 전자 이미지의 두 세트 사이의 상관 관계는 집에서 내장내는 형광 빛 현미경 스테이지를 사용하여 달성되었다. 여기에 설명 된 방법은 바이러스 숙주 세포의 상호 작용 연구,뿐 아니라 세포 신호 전달, 막 수용체 인신 매매와 같은 세포 생물학의 광범위한 응용 프로그램, 그리고 많은 다른 동적 셀 프로세스뿐만 아니라, 도움이 될 것입니다. </ P>
Introduction
cryo – 전자 단층 촬영 (cryoET)는 세포와 조직의 3 차원 (3D) 시각화를 허용하고 근접에 생리 상태 1 분자 해상도에서 기본 세포 소기관 및 세포 구조의 조직에 대한 통찰력을 제공하는 강력한 이미징 기술입니다. 그러나, 그들의 방사선 민감도와 결합 흠 냉동 수화 시편의 본질적 낮은 콘트라스트가 어려운 세포 내부 관심 분야를 찾아 연속적으로 대상 영역을 손상시키지 않고 성공적으로 기울기 시리즈를 수행 할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 빛과 전자 현미경을 결합하여 상호 접근 방식이 필요합니다. 형광 라벨에 의해 강조 특정 기능을 식별 및 형광 광학 현미경에 의해 위치, 그리고 자신의 좌표는 고해상도 3D 구조의 데이터 수집을위한 전자 현미경으로 전송됩니다 수 있습니다. 이 상관 관계 방법은 대상의 위치를하는 데 도움이관심 REAS가 해결 될 수 있습니다. cryoEM (<300 nm의)에 시료 두께 제한으로 인해, 현재 셀의 단지 주변 지역은 CryoET하여 3D 구조 분석에 적합합니다. 또한 밀링 9 유리체가 8 단면 또는 극저온 집중 이온빔 (FIB)에 의해 냉동 수화 시편의 두께를 줄이는 것은 상호 이미징의 기능을 확장 할 것이다.
이전에 상호 방법은 주로 대형 및 정적 구조 10-13 cryoET 데이터 수집을 용이하게하기 위해 사용되었다. 이 연구에서는 극저온 단계는 cryoEM 격자를 받아 직립 현미경 또는 거꾸로 현미경 10,11,14 중 하나에 맞게 구현되었습니다. 그리드를 전환하여 자신의 설계에 매우 간단 해 보이지만, EM 그리드에 대한 참여 단계를 전송하는 그리드, 변형 손상 및 오염 될 수있는 가능성을 증가 추가가 있습니다. 우리는 최근의 기술적 진보를 보여우리가 직접 감염 15 초기 단계에서 이러한 HIV-1과 숙주 세포의 상호 작용으로 촬영 자연 어려운 동적 인 이벤트를 시각화 할 수 있습니다 상호 현미경. 따라서 우리는 상관 관계를 촉진, 그리드 처리에 의한 시편의 손상을 최소화하기 위해 카트리지 시스템을 적응내는 빛 현미경 샘플 단계를 설계하고 구현하여이 작업을 수행. 우리의 디자인은 모두 극저온 빛과 cryo – 전자 현미경은 따라서 상호 프로세스를 능률화, 샘플 전송하지 않고 동일한 시편 홀더에 순차적으로 수행 할 수 있도록 통합 된 시편 카트리지 홀더가 포함되어 있습니다. 또한, 우리는 또한 기준점 표지로 형광 라텍스 구슬을 사용하여 정확하고 신뢰할 수있는 관계 절차를 구현했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 cryoET 다음 시간 경과 공 촛점 라이브 세포 형광 이미징을 사용하여 동적 세포 이벤트를 분석하는 고급 상호 접근 방식을 제공하는 프로토콜의 간단한 세트를 발표했다. 고해상도 cryoET와 3D 라이브 세포 이미징의 상관 관계를하는 우리의 방법론 개발은 숙주 세포로 희귀, 동적 (앞에서 정적보고되지 않은) 및 회절 바이러스 입자와의 상호 작용을 시각화 많은 도전 생물학적 문제를 조사하는…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술의 CRYO-형광 샘플 단계, 중국 과학 기술 대학의 Changlu 어르신과 쳉 쑤의 건설 트래비스 휠러 및 세포 생물학의학과 기계 공장 및 생리학, 피츠버그 대학교에 감사드립니다 안내, 원고의 중요한 읽기 박사 테레사 Brosenitsch. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (GM082251 & GM085043)에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
Referenzen
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
