Корреляционно микроскопии для 3D Структурный анализ динамических взаимодействий
Summary
Мы описываем корреляционный метод микроскопии, что сочетает в себе высокую скорость 3D живых клеток свете флуоресцентной микроскопии высокого разрешения и крио-электронной томографии. Показана возможность корреляционного метода динамического изображения, небольшие ВИЧ-1 частиц, взаимодействующих с клетками-хозяевами HeLa.
Abstract
Крио-электронной томографии (cryoET) позволяет 3D-визуализации клеточных структур на молекулярном разрешение в близких к физиологическим состоянием 1. Тем не менее, прямой визуализации отдельных вирусных комплексов в их среде клетки-хозяина с cryoET 2 является сложной задачей, в связи с нечастыми и динамичный характер проникновении вируса в клетку, особенно в случае ВИЧ-1. В то время как покадровой живых клеток изображений дало большое количество информации о многих аспектах жизненного цикла ВИЧ-1, 3-7, разрешение предоставляемой живых клеток микроскопии ограничена (~ 200 нм). Наша работа была направлена на разработку корреляционный метод, который позволяет прямой визуализации ранние события инфекции ВИЧ-1 путем объединения живых клеток флуоресцентной микроскопии свет, крио-флуоресцентной микроскопии и cryoET. Таким образом, живых клеток и крио-флуоресцентные сигналы могут быть использованы для точного направления выборки в cryoET. Кроме того, структурная информация, полученная из cryoET можно бэлектронной дополнена динамической функциональной данных, полученных через живые клеток изображений флуоресцентных помечены цели.
В этом видео статье мы подробно методы и протоколы для структурных исследований ВИЧ-1 и клетки-хозяина взаимодействий с использованием 3D корреляционного высокоскоростной живых клеток изображений с высоким разрешением cryoET структурного анализа. HeLa клетки, инфицированные ВИЧ-1 Частицы характеризуют первую помощью конфокальной живых клеток микроскопии и область, содержащую те же вирусные частицы затем анализировали на крио-электронной томографии для 3D структурные детали. Корреляции между двумя наборами данных изображений, оптических изображений и электронных изображений, была достигнута с помощью самодельного крио-флуоресценции световой микроскопии этапе. Подход здесь подробно будет ценен не только для изучения вирус-хозяин взаимодействий клетки, но и для более широкого применения в клеточной биологии, таких как сотовые сигнализации, торговлей мембранным рецептором, и много других динамических клеточных процессов. </ P>
Introduction
Крио-электронной томографии (cryoET) является мощным методом визуализации, которая позволяет трехмерные (3D) визуализации клеток и тканей и дает представление о родной организации органеллы и клеточные структуры на молекулярном разрешение в близких к физиологическим состоянием 1. Тем не менее, по существу низкий контраст неокрашенных замороженных гидратированный образец, в сочетании с их чувствительность к облучению, делает его трудно обнаружить области, представляющие интерес внутри клетки, а затем выполнения наклона серии успешно без повреждения целевой области. Для того чтобы преодолеть эти проблемы, корреляционный подход, который сочетает в себе световой и электронной микроскопии необходимо. Особенности подчеркивается флуоресцентное мечение определены и находятся с помощью флуоресцентной световой микроскопии, а затем их координаты передаются в электронном микроскопе на приобретение высоким разрешением 3D структурных данных. Это корреляционный метод помогает размещения целевыхREAS интереса решать. Из-за ограничений на толщину образца с cryoEM (<300 нм), в настоящее время только периферийных областей клетки подходят для 3D структурного анализа CryoET. Дальнейшее уменьшение толщины замороженных гидратированных образцов стекловидного секционирования по 8 или по крио-сфокусированного ионного пучка (FIB) 9 фрезерных бы расширить возможности корреляционного изображений.
Ранее корреляционного методов использовались в первую очередь для облегчения cryoET сбора данных для крупных и статические структуры 10-13. В этих исследованиях, крио-туров были реализованы принять cryoEM сетей и помещается на любом прямой микроскоп или инвертированный микроскоп 10,11,14. Хотя переключение сетей кажется довольно простым в своих проектах, существуют дополнительные этапы передачи для сетки EM, увеличивая вероятность того, что сетка может быть деформирована, поврежденные и загрязненные. Мы недавно продемонстрировал технический прогресс вкорреляционной микроскопии, которая позволяет нам непосредственно визуализировать динамические события, которые по своей природе трудно уловить, таких как ВИЧ-1 и взаимодействия клетка-хозяин на ранних стадиях инфекции 15. Мы добились этого путем разработки и осуществления Cryo-световой микроскопии предметный столик, который адаптирует системы картриджа, чтобы минимизировать повреждение образца из-за сетки обработки, что облегчает корреляцию. Наш дизайн включает в себя интегрированный держатель картриджа образца, что позволяет как крио-свет и крио-электронной микроскопии должны быть выполнены последовательно, на том же держателе образца, без переноса образца, что позволило бы упростить корреляционного процесса. Кроме того, мы также внедрили точной и надежной корреляции процедуры с использованием флуоресцентных латексных как координатных меток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили простой набор протоколов для обеспечения передовых корреляционный подход для анализа динамических событий с помощью сотовой покадровой конфокальной, живых клеток флуоресценции последующим cryoET. Наши методологических разработок соотнести 3D Live-ячейки изображения с выс…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Трэвис Уилер и механической мастерской на кафедре клеточной биологии и физиологии Университета Питтсбурга для строительства крио-флуоресценции образца этапе Changlu Тао и Чэн Сюй в Университете науки и технологии Китая за техническую помощи, и д-р Тереза Brosenitsch за критическое прочтение рукописи. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (GM082251 & GM085043).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
Referenzen
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
