إعداد البروتين التوحد Mgm101 بواسطة استراتيجية توصيف المستندة إلى MBP
Summary
الخميرة الميتوكوندريا البروتين نوواني، Mgm101، هو من نوع البروتين Rad52 إعادة التركيب التي تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة. يوصف بروتوكول لإعداد Mgm101 المؤتلف للذوبان باستخدام البروتين ملزمة مالتوز (ب ب) الجغرافية الاستراتيجية إلى جانب تبادل الأيونات الموجبة وحجم الاستبعاد اللوني.
Abstract
تم التعرف على الجين MGM101 قبل 20 عاما لدوره في الحفاظ على الحمض النووي. واشارت دراسات عدة مجموعات من أن البروتين Mgm101 وتشارك في إصلاح تهجيني من الحمض النووي. وأشارت التحقيقات الأخيرة التي Mgm101 تتعلق Rad52 من نوع إعادة التركيب عائلة البروتين. هذه البروتينات تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبير وتعزيز الصلب من جزيئات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مثلي. ومع ذلك، فقد أعاقت توصيف Mgm101 من صعوبة في إنتاج البروتين المؤتلف. هنا، يوصف إجراء موثوق بها لإعداد المؤتلف Mgm101. المالتوز البروتين ملزمة (ب ب) الموسومة Mgm101 يتم التعبير الأول في الإشريكية القولونية. يتم تنقيته من البروتين الانصهار في البداية من قبل أميلوز تقارب اللوني. بعد إطلاق سراحه من قبل انشقاق بروتين، يتم فصل Mgm101 من MBP بواسطة الموجبة اللوني الصرف. يتم الحصول على Monodispersed Mgm101 ثمحسب حجم الاستبعاد اللوني. العائد من ~ 0.87 ملغ من Mgm101 للتر الواحد من ثقافة البكتيرية ويمكن الحصول بشكل روتيني. وMgm101 المؤتلف ديه الحد الأدنى من التلوث من الحمض النووي. يتم استخدام عينات معدة بنجاح لالبيوكيميائية والهيكلية واحد الجسيمات تحليلات صورة Mgm101. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لإعداد البروتينات الحمض النووي ملزم بلازميدة قليلة القسيمات الكبيرة الأخرى التي يمكن أن تتجمع وسامة للخلايا البكتيرية.
Introduction
إعادة التركيب مثلي المهم لإصلاح مزدوج الجديلة فواصل (DSBs) وinterstrand crosslinks، وباستعادة تكرار الحمض النووي من تكرار الشوك المنهارة 1. في إعادة التركيب مثلي التقليدية، يتم تحفيز رد الفعل المركزي من قبل recombinases التي تعتمد على ATP بما في ذلك RECA في بدائيات النوى، وRad51 وDmc1 في حقيقيات النوى 1-3. هذه recombinases تشكيل خيوط البروتين النووي على ssDNA، التي تعتبر ضرورية للبدء في البحث عن التماثل وغزو حبلا ضمن قوالب الحمض النووي المزدوجة (الشكل 1، لوحة اليسار) 4-7. بالإضافة إلى مخطط التقليدية، ويمكن إعادة التركيب مثلي أيضا أن تأخذ مكان بطريقة RecA/Rad51-independent (الشكل 1، لوحة على اليمين). على سبيل المثال، يمكن أن الخميرة Rad52 وRad59 البروتينات تحفز بشكل مباشر على الصلب من فروع ssDNA التكميلية التي يتعرض لها من قبل resectioning من فواصل dsDNA. هذه العملية إعادة التركيب، والمعروفة باسم الغناءجنيه حبلا الصلب، وعموما لا تنطوي على الاقتران مثلي مع القوالب dsDNA. بعد الصلب، يتم إزالة ذيول مغاير من قبل exonucleases وو تربط النكات لاستعادة 8-10 استمرارية الجينوم. وغالبا ما يترافق إصلاح من قبل آلية الصلب حبلا واحد عن طريق الحذف من تسلسل الجينوم بين المناطق المتكررة مباشرة.
Rad52 ينتمي إلى مجموعة متنوعة من البروتينات إعادة التركيب التي هي على نطاق واسع بين البكتيريا 11. وتعرف هذه البروتينات أيضا باسم ضفيرة واحدة البروتينات التليين (SSAPs)، على أساس نشاطهم في تعزيز الصلب من جزيئات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مثلي. أفضل SSAPs البكتيريا تتميز هي Redβ وإيرف من البكتيريا λ وP22، مصحح من RAC طليعة العاثية والبروتين ساك من فج lactococcal ul36. وتتميز هيكليا SSAPs من قبل أضعاف β-β-β-α نموذجي، على الرغم من التشابه هو undetect تقريباقادرة في تسلسل الابتدائي. أنهم جميعا شكل حلقات هومو بلازميدة قليلة القسيمات كبير من 10-14 أضعاف التناظر في المختبر 12-14. الآثار الوظيفية لهذه المنظمة مميزة مرتبة أعلى الهيكلية ليست مفهومة جيدا.
ونحن مهتمون في فهم آلية إعادة التركيب مثلي في الجينوم الميتوكوندريا. حددنا سابقا الجين MGM101 التي لا غنى عنها للحفاظ على و mtDNA في خميرة الخباز 15. تم العثور MGM101 في وقت لاحق أن تكون مرتبطة مع nucleoids الميتوكوندريا ومطلوب من أجل التسامح و mtDNA من الحمض النووي للعوامل المضرة 16. ومع ذلك، فقد تم عقد دراسة Mgm101 مرة أخرى في العقد الماضي من قبل صعوبة لإنتاج Mgm101 المؤتلف. لقد نجحنا مؤخرا في إنتاج Mgm101 قابل للذوبان في كميات كبيرة من E. القولونية باستخدام استراتيجية MBP الانصهار. وقد مكن هذا لنا لإثبات أن Mgm101 سهمأوجه التشابه البيوكيميائية والهيكلية مع Rad52-عائلة من البروتينات 17،18. في هذا التقرير، وصفت إجراء تنقية ثلاث خطوات، والتي تنتج Mgm101for التحليلات البيوكيميائية والهيكلية متجانس (الشكل 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد كان التحدي لإنتاج مستقر، وأصلي المؤتلف Mgm101 البروتين من E. القولونية وربما يعود ذلك إلى الذوبان في الخلايا البكتيرية. في هذا التقرير، وتبين لنا أن الاستراتيجية MBP الانصهار يسمح للبروتين أن أعرب على مستوى عال إلى حد معقول. باستخدام السلبية تلطيخ انتقال المجهر ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر يلكنز ستيفان لمساعدة في انتقال المجهر الإلكتروني. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AG023731.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
Referenzen
- San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
- Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
- Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
- Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
- Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
- Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
- Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
- Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetik. 153, 1117-1130 (1999).
- Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
- Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
- Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
- Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
- Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
- Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
- Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
- Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
- Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
- Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
- Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
- Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
- Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).
