Bereiding van de Mgm101 recombinatie eiwit met MBP-based Tagging strategie
Summary
De gist mitochondriale nucleoid eiwit, Mgm101, is een rad52-soort recombinatie eiwit dat grote oligomere ringen vormt. Een protocol wordt beschreven aan oplosbare recombinant Mgm101 bereiden met behulp van de maltosebindingseiwit (MBP)-tagging strategie in combinatie met kationuitwisseling en size exclusion chromatografie.
Abstract
De MGM101 gen werd 20 jaar geleden geïdentificeerd voor zijn rol in het onderhoud van mitochondriaal DNA. Studies uit verschillende groepen hebben gesuggereerd dat de Mgm101 eiwit betrokken is bij de reparatie van recombinational mitochondriaal DNA. Recente onderzoekingen hebben aangegeven dat Mgm101 is gerelateerd aan het RAD52 type recombinatie eiwitfamilie. Deze eiwitten vormen grote oligomere ringen en bevordering van de annealing van de homologe enkelstrengs DNA-moleculen. Echter, de karakterisering van Mgm101 gehinderd door de moeilijkheid in het produceren van het recombinante eiwit. Hier is een betrouwbare werkwijze voor de bereiding van recombinant Mgm101 beschreven. Maltose bindend eiwit (MBP)-gelabeld Mgm101 eerst tot expressie in Escherichia coli. Het fusie-eiwit wordt eerst gezuiverd door affiniteitschromatografie amylose. Na zijn vrijlating door proteolytische splitsing, wordt Mgm101 gescheiden van MBP door kationische uitwisselingschromatografie. Monodisperse Mgm101 wordt dan verkregendoor grootte-uitsluitingschromatografie. Een opbrengst van -0,87 mg Mgm101 per liter bacteriekweek kan routinematig verkregen. De recombinant Mgm101 heeft minimale verontreiniging van DNA. De geprepareerde monsters worden met succes gebruikt voor biochemische, structurele en single particle image analyses van Mgm101. Dit protocol kan ook gebruikt worden voor de bereiding van andere grote oligomere DNA-bindende eiwitten die kunnen worden verkeerd gevouwen en giftig voor bacteriële cellen.
Introduction
Homologe recombinatie is belangrijk voor de reparatie van dubbelstrengige breuken (DSB) en InterStrand verknopingen en de her-initiatie van DNA replicatie van ingestorte replicatievorken 1. In conventionele homologe recombinatie, wordt de centrale reactie gekatalyseerd door de ATP-afhankelijke recombinases zoals RecA in prokaryoten en Rad51 en DMC1 in eukaryoten 1-3. Deze recombinasen vormen nucleoproteïne filamenten ssDNA, die essentieel zijn voor het initiëren homologieonderzoek en streng invasie in duplex DNA-matrijzen (figuur 1, linker paneel) 4-7 zijn. Naast de gebruikelijke regeling kan homologe recombinatie ook plaatsvinden in een RecA/Rad51-independent wijze (Figuur 1, rechter paneel). Zo kan de gist Rad59 eiwitten RAD52 en direct katalyseren het hybridiseren van complementaire ssDNA strengen die worden blootgesteld door wegsnijden van dsDNA onderbrekingen. Deze recombinatie proces, bekend als zingenle streng gloeien, over het algemeen niet gepaard homoloog koppeling met dsDNA templates. Na hybridisatie worden heterologe staarten verwijderd door exonucleasen en nicks worden geligeerd aan genoom continuïteit 8-10 herstellen. Reparatie door de enkele streng gloeien mechanisme wordt vaak vergezeld door deleties van genomische sequenties tussen direct herhaalde regio.
Rad52 behoort tot een diverse groep van recombinatie eiwitten die wijdverbreid onder bacteriofagen 11. Deze eiwitten zijn ook bekend als Single Strand Gloeien Proteins (SSAPs), op basis van hun activiteit bij het bevorderen van de annealing van de homologe enkelstrengs DNA-moleculen. De beste gekenmerkt bacteriofaag SSAPs zijn Redp en Erf uit de bacteriofagen λ en P22, RecT uit de profaag rac en de Sak eiwit uit de lactococcale faag ul36. De SSAPs structureel zijn typische β-β-β-α voudig, hoewel overeenstemming vrijwel undetectkunnen in de primaire sequenties. Ze maken allemaal grote homo-oligomere ringen van 10 – 14 voudige symmetrie in vitro 12-14. De functionele implicaties van deze karakteristieke hogere orde structurele organisatie is niet goed begrepen.
Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen van het mechanisme van homologe recombinatie in het mitochondriaal genoom. We hebben eerder geïdentificeerd MGM101 het gen dat essentieel is voor het behoud van mtDNA in Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 bleek vervolgens worden geassocieerd met mitochondriale nucleoids en is vereist voor de tolerantie van mtDNA aan DNA-beschadigende middelen 16. Echter, de studie van Mgm101 werd weer gehouden in de afgelopen tien jaar door de moeilijkheid om recombinant Mgm101 produceren. We hebben onlangs in geslaagd in het produceren van oplosbare Mgm101 op grote hoeveelheden van E. coli met behulp van de MBP-fusie strategie. Dit heeft ons in staat aan te tonen dat Mgm101 aandelenbiochemische en structurele overeenkomsten met de rad52-familie van eiwitten 17,18. In dit rapport wordt een drie-stappen zuivering procedure beschreven, die homogeen Mgm101for biochemische en structurele analyses (figuur 2) produceert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is een uitdaging om een stabiele, inheemse recombinant Mgm101 eiwit uit E. coli mogelijk vanwege zijn onoplosbaarheid in bacteriële cellen. In dit verslag tonen we dat het MBP-fusie-strategie kan het eiwit op een redelijk hoog niveau tot expressie. Door negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie en gelpermeatiechromatografie, hebben we eerder aangetoond dat de MBP-fusie-eiwit vormt oligomeren uniform in vitro 18. Het is mogelijk dat de vouwen en oligomerisatie van Mgm101 langz…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Stephan Wilkens voor hulp bij transmissie elektronenmicroscopie. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant R01AG023731.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
Referenzen
- San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
- Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
- Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
- Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
- Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
- Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
- Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
- Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetik. 153, 1117-1130 (1999).
- Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
- Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
- Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
- Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
- Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
- Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
- Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
- Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
- Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
- Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
- Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
- Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
- Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).
