纵向，非侵入性的移植到眼睛的前房<em在体内</em>单细胞分辨率的实时成像
Summary
眼内移植和共聚焦显微镜相结合的一种新的方法移植组织内，使纵向的，非侵入性的单细胞分辨率的实时成像<em在体内</em>。我们演示了如何胰岛细胞移植到老鼠的眼睛前房。
Abstract
活体成像已成为生物学研究的一个不可缺少的工具。的过程中，许多成像技术已经发展到在非侵入性动物研究的不同生物过程。然而，一个重要的技术在现有的活体成像方式的限制是无法以非侵入性的结合，纵向成像与单细胞的分辨能力。我们在这里展示，如何移植进入前房的眼睛，会在显着的限制，提供一个多功能的实验平台，使非侵入性的， 体内细胞高分辨率成像与纵向。我们展示了鼠标和移植过程中使用的模型与临床相关性，即胰岛移植提供有代表性的结果。除了能够直接可视化的各种组织移植到眼的前房，这种方法提供了一个平台，卵石Ň药物进行长期的跟进和监测靶组织中。由于它的多功能性，组织/细胞移植到眼睛的前房不仅有利于移植疗法，它延伸到其它在体内应用研究的生理和病理生理过程，如信号转导和癌症或自身免疫性疾病的发展。
Introduction
在活体显微镜的进展显示，预计不会在体外研究中的生理现象。这突出表明在体外培养的方法，通过常规的活的动物的研究结果，在翻译的挑战。在过去的十年中，大大改善生活的动物的组织中的可视化技术进步的成像方式2，3，4，5，6。这促使需要在体内成像方法与可行的在实验动物模型中的应用，使纵向的非侵入性的靶组织的可视化。
启用非侵入性的成像技术，如磁共振成像和正电子发射断层扫描或生物发光成像的器官/组织深身体内的7-8，9。但是，这些技术无法实现单细胞分辨率高的背景信号和低空间分辨率，但使用of高对比度的材料或组织特异性的发光4。这是解决与双光子荧光共焦显微镜10的到来。双光子显微镜活体成像研究，以前所未有的细节11，12，可视化和量化细胞的活动。这导致了在健康和疾病的13，14，15，16中的关键的生物过程的表征。开拓性的活体成像研究主要是“模仿” 在体内切除的组织（ 如淋巴结）的条件，但其他研究已经使用侵入性的方法，图像暴露目标组织在原位 17日，18日，19日，20日，21。其他研究也使用“窗口室模式”，以规避限制，与侵入性方法和有限的成像分辨率在体内 22日，23日，24日，25。在窗口中的腔模型中，一个腔室与一个透明的窗口是在不同的外科手术植入到皮肤租金位置（背侧或耳部皮肤，乳腺脂肪垫，肝等）上的动物（ 如小鼠，大鼠，兔）。虽然这种做法显然使高分辨率成像在体内 ，它需要一个微创手术植入室，可能无法以适应纵向成像研究在数周或数个月22。
这是最近展示了一种微创手术，即移植到前房的眼睛，结合高分辨率的共聚焦显微镜（ACE）提供了一个“自然的身体”窗口“作为一个强大和灵活的体内成像平台，26日，27。移植到ACE在过去的几十年中被用于研究生物方面的各种组织28日，29日，30和其最近的高分辨率成像结合，使胰岛生理研究单细胞分辨率的非侵入和纵向<sup>的26，27。这种方法被用于研究自身免疫反应，在开发过程中的1型糖尿病的动物模型（未发表资料）。它也被用来研究胰腺发育，以及，在肾功能的研究，通过移植到的ACE胰芽或个别肾小球，分别为（未发表的数据）。最近的一份报告使用这种方法进一步证明其研究中的应用胰岛移植31后的免疫反应。更重要的是，本研究表明，移植到的眼球的前房中，提供了一种自然的身体窗口来执行：（1） 在体内的移植组织的纵向的，非侵入性的成像，（2） 在体内 cytolabeling评估细胞表型和生存能力原位 ;（3）实时跟踪，在靶组织中的免疫细胞浸润;（4）通过局部应用或眼内注射的地方干预。
在这里，我们ðemonstrate如何进入前房的眼睛胰岛进行移植。
Protocol
Representative Results
Discussion
小鼠胰岛分离使用胶原酶消化其次密度梯度纯化，如前所述，33。胰岛移植前培养过夜。虽然这可能不是必需的，它建议允许从隔离过程中恢复的胰岛。这是因为这将确保幸存的/强大的胰岛细胞移植时，移植糖尿病的收件人进行。
移植全身麻醉下进行，与氧/异氟醚混合物（1.5-3％）吸入效果。可以用来替代吸入或注射麻醉剂（ 例如，氯胺酮）。如果注射麻醉?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们承认博士。斯蒂芬R.华军莫拉诺，卡米洛里科尔迪，安东内洛Pileggi，Speier和丹尼尔Nyqvist富有成果的讨论。我们也感谢鲁特埃尔南德斯和迭戈·埃斯皮诺萨Heidmann技术援助和麦克·巴尔德斯和玛格丽特福莫苏，具有视频录制的帮助。拜伦马尔多纳多记录，编辑和制作最终的视频。研究提供了支持;美国国立卫生研究院糖尿病研究基金会（ www.DiabetesResearch.org ），美国国立卫生研究院/ NIDDK / NIAID（F32DK083226 MHA RO3DK075487 AC; U01DK089538 PO.B.）。通过资金来自卡罗林斯卡医学院，瑞典研究委员会，瑞典糖尿病基金会，家庭二苓佩尔松基金会，家庭克努特和Alice Wallenberg基金会，瑞泰人寿保险股份有限公司，充满活力的进一步的研究提供了支持PO.B（ FP7-228933-2），卡罗林斯卡研究所战略研究计划在糖尿病itutet，诺和诺德基金会，和泊位冯Kantzow的的基础。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
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