Transplantation dans la chambre antérieure de l'oeil pour longitudinale, non-invasive<em> In vivo</em> Imagerie avec une seule cellule de résolution en temps réel
Summary
Une nouvelle approche combinant la greffe intraoculaire et la microscopie confocale permet longitudinale, non-invasive imagerie en temps réel avec une seule cellule de résolution au sein des tissus greffés<em> In vivo</em>. Nous démontrons comment transplanter les îlots pancréatiques dans la chambre antérieure de l'œil de la souris.
Abstract
Intravitale imagerie est devenue un outil indispensable dans la recherche biologique. Dans le processus, les techniques d'imagerie nombreux ont été développés pour étudier différents processus biologiques chez les animaux non-invasive. Cependant, une limitation technique majeur existants modalités d'imagerie intravitale est l'incapacité de combiner non invasive, l'imagerie longitudinale avec des capacités de résolution unicellulaires. Nous montrons ici comment la transplantation dans la chambre antérieure de l'œil contourne cette limitation significative en offrant une plate-forme expérimentale polyvalente qui permet aux non-invasive, l'imagerie longitudinale avec une résolution cellulaire in vivo. Nous démontrons la procédure de transplantation chez la souris et de fournir des résultats représentatifs à l'aide d'un modèle avec pertinence clinique, à savoir transplantation d'îlots pancréatiques. En plus de permettre une visualisation directe dans une variété de tissus transplantés dans la chambre antérieure de l'œil, cette approche fournit une plate-forme d'éboulisn en effectuant des médicaments à long terme de suivi et de surveillance dans les tissus cibles. En raison de sa polyvalence, le tissu / la transplantation de cellules dans la chambre antérieure de l'œil non seulement les thérapies de transplantation avantages, elle s'étend à d'autres applications in vivo pour étudier les processus physiologiques et physiopathologiques tels que la transduction du signal et de cancers ou développer maladie auto-immune.
Introduction
Les progrès de la microscopie intravitale ont révélé des phénomènes physiologiques non prévus par les études in vitro 1. Cela met en évidence le défi de traduire les résultats obtenus par des méthodes in vitro conventionnelle dans l'animal vivant. Dans la dernière décennie, la visualisation des tissus chez les animaux vivants a été considérablement améliorée par les avancées technologiques en 2 modalités d'imagerie, 3, 4, 5, 6. Cela a suscité un besoin pour des approches d'imagerie in vivo avec une application possible dans des modèles animaux expérimentaux pour permettre la visualisation longitudinale des tissus cibles de façon non invasive.
Les techniques d'imagerie telles que l'imagerie par résonance magnétique et la tomographie par émission de positons ou bioluminescence ont permis à l'imagerie non invasive des organes / tissus profonds dans le corps 7-8, 9. Mais ces techniques ne peuvent pas réaliser seule cellule de résolution en raison de signaux de fond élevés et la faible résolution spatiale, en dépit de l'utilisation of matériaux à fort contraste ou tissu-spécifique 4 luminescence. Cela a été abordée avec l'avènement de la microscopie à deux photons de fluorescence confocale 10. Microscopie à deux photons a permis des études d'imagerie intravitale de visualiser et de quantifier les événements cellulaires avec des détails sans précédent 11, 12. Cela a conduit à la caractérisation des processus biologiques essentiels en matière de santé et de la maladie 13, 14, 15, 16. Alors que pionnier des études d'imagerie ont principalement intravitale "imité" in vivo dans le tissu excisé (ganglions lymphatiques, par exemple), d'autres études ont utilisé des approches invasives dans les tissus cibles d'images exposées in situ 17, 18, 19, 20, 21. D'autres études ont également utilisé des "modèles" fenêtre de la chambre de contourner les limitations associées à des approches invasives et la résolution d'imagerie in vivo limitée 22, 23, 24, 25. Dans le modèle de fenêtre de chambre, une chambre avec une fenêtre transparente est implanté chirurgicalement sous la peau à difféemplacements de loyer (peau du dos ou de l'oreille, mammaire coussinet adipeux, le foie, etc) sur l'animal (par exemple souris, rat, lapin). Bien que cette approche permet clairement à haute résolution pour l'imagerie in vivo, il nécessite une chirurgie invasive pour implanter la chambre et peut ne pas être en mesure d'accueillir les études d'imagerie longitudinales sur plusieurs semaines ou mois 22.
Il a été récemment démontré que la combinaison de haute résolution microscopie confocale à une procédure minimalement invasive, à savoir la transplantation dans la chambre antérieure de l'œil (ACE) offre une «fenêtre naturelle du corps" comme un. Puissant et polyvalent d'imagerie in vivo plate-forme 26, 27 Transplantation dans le ACE a été utilisé dans les dernières décennies pour étudier les aspects biologiques d'une grande variété de tissus 28, 29, 30, et sa combinaison récente avec l'imagerie haute résolution a permis l'étude de la physiologie des îlots pancréatiques avec une seule cellule de résolution non- invasive et longitudinalement <sup> 26, 27. Cette approche a été utilisée pour étudier les réactions auto-immunes au cours du développement du diabète de type 1 dans des modèles animaux (données non publiées). Il a également été utilisé pour étudier le développement du pancréas, ainsi que, dans les études de la fonction rénale par la transplantation dans les bourgeons pancréatiques de l'ECA ou individuels glomérules rénaux, respectivement (données non publiées). Un rapport récent de cette approche en outre démontré son application à étudier les réponses immunitaires après transplantation d'îlots pancréatiques 31. Surtout, cette étude a montré que la transplantation dans la chambre antérieure de l'oeil offre une fenêtre naturelle du corps pour effectuer: (1) longitudinal, l'imagerie non-invasive de tissus transplantés in vivo, (2) in vivo pour évaluer cytolabeling phénotype cellulaire et la viabilité de situ, (3) suivi en temps réel de l'infiltration des cellules immunitaires dans le tissu cible, et (4) une intervention locale en application topique ou par injection intra-oculaire.
Ici, nous avons Demonstrate comment effectuer la transplantation dans la chambre antérieure de l'oeil à l'aide des îlots pancréatiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Îlots pancréatiques murins ont été isolés par digestion à la collagénase suivie d'une purification sur gradient de densité, comme décrit précédemment 33. Îlots isolés ont été cultivées pendant une nuit avant la transplantation. Bien que cela ne soit pas nécessaire, il est recommandé de permettre aux îlots de se remettre de la procédure d'isolement. Cela est essentiel si la transplantation est effectuée chez les receveurs diabétiques car elle garantit la transplantation d'îlo…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons les Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier et Daniel Nyqvist pour des discussions fructueuses. Nous remercions également Eleut Hernandez et Diego Espinosa-Heidmann pour l'assistance technique, et Mike Valdes et Margaret Formoso de l'aide pour l'enregistrement vidéo. Byron Maldonado a enregistré, édité et produit la vidéo finale. Soutien à la recherche a été fourni par la Fondation Diabetes Research Institute ( www.DiabetesResearch.org ), le NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 à MHA; NIH RO3DK075487 à AC; U01DK089538 à PO.B.). Soutien additionnel à la recherche PO.B a été fournie par des fonds provenant du Karolinska Institutet, le Conseil de recherche suédois, la Fondation du diabète suédois, la famille Erling Persson-Foundation, la famille Knut et Alice Wallenberg Foundation, le Skandia Insurance Company Ltd, VIBRANT ( FP7-228933-2), le Programme stratégique de recherche sur le diabète au Karolinska institutet, la Fondation Novo Nordisk, et la Fondation Berth von Kantzow l'.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
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