Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura
Summary
Células neuroprogenitoras Humanos (NPCs) foram expandidas em condições de proliferação. NPCs foram diferenciadas em culturas ricas em neurônios na presença de uma combinação de neurotrofinas. Marcadores neuronais foram detectadas pela técnica de imunofluorescência. Para isolar uma população pura de neurônios, NPCs foram diferenciadas em PEN lâminas de membrana e captura de microdissecção a laser foi realizada.
Abstract
Células neuroprogenitoras (NPCs) isoladas a partir do cérebro de feto humano foram expandidas sob condições proliferativas em presença do factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), para proporcionar um fornecimento abundante de células. NPCs foram diferenciadas na presença de uma nova combinação de factor de crescimento do nervo (NGF), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), dibutiril AMPc (DBC) e ácido retinóico em pratos revestidos com poli-L-lisina e laminina rato para obter neurónio ricas culturas. NPCs também foram diferenciadas na ausência de neurotrofinas, a DBC e ácido retinóico e na presença do factor neurotrófico ciliar (CNTF) para produzir culturas ricas em astrócitos. NPCs diferenciadas foram caracterizadas por coloração de imunofluorescência para um painel de marcadores neuronais incluindo NeuN, sinapsina, acetilcolinesterase, sinaptofisina e GAP43. Proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e STAT3, marcadores de astrócitos, foram detectados em 10-15% dos NPCs diferenciadas. Para facilitarCaracterização molecular específicos do tipo de célula, a captura de microdissecção a laser foi realizada para isolar neurónios cultivados em naftalato de polietileno (PEN) de lâminas de membrana. Os métodos descritos neste estudo fornecem ferramentas valiosas para avançar nossa compreensão do mecanismo molecular da neurodegeneração.
Introduction
Neurogénese longo da vida, é conhecido por ocorrer na zona subventricular dos ventrículos laterais e na camada subgranular do giro dentado do cérebro de mamíferos adultos 1. Células neuroprogenitoras (NPCs) que se originam a partir destas regiões são células multipotentes que podem se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos 2. NPCs gerado interesse devido ao seu potencial para ser transplantadas em pacientes com várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer (AD) 3. Estudos com NPCs geralmente centrada sobre este ângulo de transplante, mas o potencial de neurónios NPC-derivados como um modelo de cultura de células para determinar o mecanismo de neurodegeneração não foi totalmente explorada. Estudos anteriores têm geralmente utilizados os neurónios pós-mitóticos, isolado a partir de tecidos do cérebro de roedores, que devem ser isoladas para cada experiência em que não sejamauto-renovação. Embora as linhas celulares de neuroblastoma humano, incluindo SH-SY5Y e células SK-N-MC pode ser expandido, elas não têm as características de neurónios primários. NPCs humanos, por outro lado, oferecem vantagens porque eles podem ser expandidos para várias passagens e podem ser diferenciados para gerar uma população de células com as características primárias de neurónios 4,5. No presente estudo, descrevemos um novo protocolo de diferenciação para se obter uma população rica em neurônio consistente de NPCs disponíveis comercialmente isoladas de cérebro fetal humano. Porque essas culturas contêm uma pequena porcentagem de células gliais, precisamos de métodos adicionais para isolar uma população pura de neurônios para caracterização molecular. Captura laser microdissecção (LCM) é um nova técnica pela qual uma população homogénea de células a partir de uma secção de tecido podem ser capturadas selectivamente para análise da expressão do gene 6. O cérebro é um tecido heterogêneo composto por neurônios, células gliais e outros ty celularpes. LCM foi utilizado para determinar a expressão de genes específicos de neurónios analisa 7-10. Temos realizado anteriormente LCM de neurônios do hipocampo de AD (Tg2576) seções do cérebro do rato para mostrar a diminuição da expressão de proteína de ligação elemento de resposta ao AMP cíclico (CREB) e BDNF especificamente nos neurônios do hipocampo 11. No presente estudo, descrevemos os procedimentos para a expansão dos NPCs humanos, a diferenciação neuronal, coloração de imunofluorescência para marcadores neuronais e LCM para o isolamento de neurônios cultivados em PEN lâminas de membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos neste estudo um modelo de cultura de células ricas em neurônio pela diferenciação de células neuroprogenitoras humanos auto-renovação e um método para isolar uma população pura de neurônios por captura de microdissecção a laser. Nós usamos uma combinação de NGF, BDNF, DBC e ácido retinóico para a diferenciação neuronal de NPCs. DBC é usada para ativar CREB, um fator de transcrição que aumenta a neurogênese 12. O ácido retinóico induz saída do ciclo celular e reduz a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por Mérito comentário concessão (NEUD-004-07F) da Administração de Veteranos (para SP).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
Referenzen
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