Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo
Summary
Células neuroprogenitoras Humanos (CPN) se ampliaron en condiciones proliferantes. NPC se diferenciaron en cultivos de neuronas-rica en la presencia de una combinación de neurotrofinas. Marcadores neuronales se detectaron por tinción de inmunofluorescencia. Para aislar una población pura de las neuronas, NPCs se diferenciaron en láminas de membrana PEN y se realizó con láser captura microdissection.
Abstract
Células neuroprogenitoras (NPC) aislados a partir de cerebro fetal humano se ampliaron en condiciones proliferativas en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) para proporcionar un suministro abundante de células. NPC fueron diferenciadas en la presencia de una nueva combinación de factor de crecimiento nervioso (NGF), derivado del cerebro factor neurotrófico (BDNF), dbAMPc (DBC) y ácido retinoico en platos recubiertos con poli-L-lisina y laminina de ratón para obtener neurona ricas culturas. NPC también se diferenciaron en ausencia de las neurotrofinas, DBC y ácido retinoico y en presencia de factor neurotrófico ciliar (CNTF) para producir cultivos de astrocitos-rica. NPC diferenciadas se caracterizan por la tinción de inmunofluorescencia para un panel de marcadores neuronales incluyendo NeuN, sinapsina, la acetilcolinesterasa, sinaptofisina y GAP43. Proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y STAT3, marcadores de astrocitos, se detectaron en el 10-15% de los NPCs diferenciadas. Para facilitartipo de célula caracterización molecular específica, se realizó la captura de microdisección láser para aislar las neuronas cultivadas en polietilennaftalato (PEN) se desliza de membrana. Los métodos descritos en este estudio proporcionan valiosas herramientas para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares de la neurodegeneración.
Introduction
Neurogénesis largo de la vida se sabe que se producen en la zona subventricular de los ventrículos laterales y en la capa de subgranular del giro dentado del cerebro adulto de mamíferos 1. Células neuroprogenitoras (NPCs) que se originan en estas regiones son células pluripotentes que pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos 2. NPC han generado interés debido a su potencial para ser trasplantadas en pacientes con diversos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, accidente cerebrovascular y enfermedad de Alzheimer (EA) 3. Los estudios con NPCs han centrado generalmente en este ángulo el trasplante, pero el potencial de las neuronas derivadas de la APN como un modelo de cultivo celular para determinar el mecanismo de neurodegeneración no se ha explotado plenamente. Estudios previos han utilizado generalmente las neuronas post-mitóticas aisladas de tejidos cerebrales de roedores que necesitan ser aislados para cada experimento, ya que no sonauto-renovación. Aunque las líneas celulares de neuroblastoma humano incluyendo las células SK-N-MC SH-SY5Y y se pueden ampliar, que no tienen las características de las neuronas primarias. NPC Humanos, por otro lado, ofrecen tanto ventajas porque pueden ser expandido para múltiples pasajes y se pueden diferenciar para generar una población de células con las características de las neuronas primarias de 4,5. En el presente estudio, se describe un nuevo protocolo de diferenciación para obtener una población de neuronas ricas consistente de NPCs disponibles comercialmente aisladas de cerebro fetal humano. Debido a que estos cultivos contienen un pequeño porcentaje de las células gliales, que necesitamos métodos adicionales para aislar una población pura de las neuronas para la caracterización molecular. Microdisección de captura por láser (LCM) es una nueva técnica por la que una población homogénea de células de una sección de tejido puede ser capturado de forma selectiva para el análisis de la expresión génica 6. El cerebro es un tejido heterogéneo que consta de neuronas, glía y otras células Types. LCM se ha utilizado para determinar la expresión génica específica de las neuronas análisis 7-10. Hemos realizado anteriormente mcm de las neuronas del hipocampo de AD (Tg2576) secciones de cerebro de ratón para mostrar disminución de la expresión de la proteína de unión al elemento de respuesta a AMP cíclico (CREB) y BDNF específicamente en las neuronas del hipocampo 11. En el presente estudio, se describe los procedimientos para la expansión de los NPCs humanos, la diferenciación neuronal, la tinción de inmunofluorescencia de marcadores neuronales y LCM para el aislamiento de las neuronas cultivadas en portaobjetos de membrana PEN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe en este estudio un modelo de cultivo celular de la neurona-rica por la diferenciación de las células neuroprogenitoras humanos auto-renovación y un método para aislar una población pura de las neuronas mediante láser captura microdissection. Hemos utilizado una combinación de NGF, BDNF, DBC y el ácido retinoico para la diferenciación neuronal de NPCs. DBC se utiliza para activar CREB, un factor de transcripción que mejora la neurogénesis 12. El ácido retinoico induce la salida del cicl…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el subsidio Revisión Mérito (NEUD-004-07F) de la Administración de Veteranos (SP).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
Referenzen
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer’s brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
